兴安杜鹃3种主要成分的HPLC测定及其对大鼠气管平滑肌的舒张作用

[目的]建立同时测定兴安杜鹃中金丝桃苷、槲皮素和杜鹃素含量的高效液相色谱法(HPLC),并探讨兴安杜鹃提取物及3种主要成分对大鼠气管平滑肌舒张作用的影响及其作用机制。[方法]采用HPLC法测定兴安杜鹃中金丝桃苷、槲皮素和杜鹃素的含量并进行方法学考察。采用离体气管灌流法取大鼠气管环,将气管环固定于麦氏浴皿中,使用扑尔敏、吲哚美辛、格列苯脲、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、硝苯地平和普萘洛尔进行预孵育,待气管环张力稳定后,加入60 mmol/L KCl溶液收缩气管环,进行兴安杜鹃对气管环的舒张试验,观察大鼠气管平滑肌张力变化。[结果]兴安杜鹃中3种主要成分HPLC测定方法考察结果显示,3种成分均在2~80μg/mL线性关系良好,平均回收率分别为金丝桃苷100.3%(RSD=2.63%)、槲皮素102.7%(RSD=2.89%)、杜鹃素102.1%(RSD=2.36%)。在吲哚美辛、格列本脲和普萘洛尔孵育组织中,兴安杜鹃提取物及3种单体成分的舒张作用与未孵育组相比没有显著差异;在扑尔敏、L-NAME和硝苯地平孵育的组织中,兴安杜鹃及金丝桃苷与未孵育的组织相比有显著差异,舒张作用有所降低。这种现象可能是通过抑制组胺H1受体、一氧化氮合酶途径和钙离子通道介导的钙离子内流实现的。[结论]该试验建立的方法简单、准确,能快速测定兴安杜鹃中金丝桃苷、槲皮素和杜鹃素的含量,为其质量评价和控制提供了有效的分析手段;并且这3种成分与兴安杜鹃舒张气管的作用有关,可作为支气管扩张剂开发的理论依据。

满山红配方颗粒提取工艺优化及质量标准研究

对满山红配方颗粒的提取工艺进行优化,并建立了相应的质量标准,为其临床应用奠定基础。采用单因素试验结合Box-Behnken响应面法进行研究,以出膏率和杜鹃素含量为评价指标,对提取次数、提取时间和加水倍数进行考察,利用高效液相色谱法(HPLC)对杜鹃素含量进行定量测定,得出各因素对出膏率和杜鹃素含量的影响程度,并依据《中华人民共和国药典》2020年版,采用薄层鉴别法对满山红进行定性分析。通过Box-Behnken中心组和设计模型分析回归模型方差以及响应面图,确认满山红的最佳提取条件为:提取4次,提取时间2 h,加水18倍。薄层鉴别法显示,满山红斑点清晰,重现性佳,高效液相色谱法也显示出高度的准确性和重复性。优化后的满山红配方颗粒提取工艺操作简便、稳定可行,为满山红的深度开发和利用提供了科学依据。

RP-HPLC法测定满山红叶及其制剂中杜鹃素含量

目的 建立 RP- HPL C测定满山红叶及其制剂芩暴红胶囊中杜鹃素含量的方法。方法 固定相为 Shim-Pack VP- ODS反相柱 ;流动相为甲醇 -水 ( 65 .5∶ 3 4 .5 ) ;检测波长 2 96nm。结果 该方法的线性范围为 0 .1～2 .0 μg,r=0 .9991;平均回收率为 96.60 % ,RSD=1.0 7% ( n=5 )。结论 本法简便 ,准确 ,灵敏度高 ,重现性好 。

高效液相色谱法快速测定满山红中槲皮素和杜鹃素的研究

研究了用固相萃取预分离，高效液相色谱法测定满山红中槲皮素和杜鹃素。槲皮素和杜鹃素用90%甲醇加热回流提取，提取液用Waters Sep-Pak-C18固相萃取小柱预分离，然后用ZORBAX Stable Bound（50×4．6mm i．d．，1．8μm）色谱柱，以O．2％的磷酸和甲醇（52：48，V／v）为流动相，槲皮素和杜鹃素在1．0min内可达到基线分离；用紫外二极管矩阵检测器检测。方法的加入标准回收率为98％～102％，相对标准偏差为1．6％～1．8％。本法可用于满山红样品中的槲皮素和杜鹃素的测定，结果满意。

高效薄层扫描法测定166种杜鹃中6种黄酮类成分的含量

在高效硅胶薄层板上以石油醚(bp60～90℃)—乙醚—甲酸(62:31:7)的上层(展开剂Ⅰ)分离杜鹃素、山奈素和槲皮素;扫描测定后再次展开,以氯仿—甲醇—水(7:3:1)的下层—甲酸(7:0.5)(展开剂Ⅱ)分离蓼属甙、槲皮甙干口金丝桃甙。用瑞士Camag 76510型单波长薄层扫描仪进行直线扫描,测定波长366nm,用美国Hewlett Packard 3390 A型积分仪测出峰面积。测定了166种杜鹃叶中上述6种黄酮类成分的含量。

芩暴红止咳胶囊中紫丁香苷杜鹃素黄芩苷含量的高效液相色谱测定

目的建立芩暴红止咳胶囊中紫丁香苷、黄芩苷、杜鹃素的一测多评含量测定方法。方法采用AlltimaHP—C18柱，流动相为甲醇-0．2％磷酸溶液梯度洗脱，检测波长为275nm，建立芩暴红止咳胶囊中紫丁香苷、黄芩苷、杜鹃素HPLC含量测定方法。结果紫丁香苷在0．1016—1．016μg范围内线性关系良好，黄芩苷在0．01915—0．01915μg范围内线性关系良好，杜鹃素在0．04152—0．4152μg范围内线性关系良好。紫丁香苷、黄芩苷、杜鹃素平均回收率（n=6）分别为100．32％，98．82％，98．65％，RSD分别为1．8％，1．9％，1．1％。结论该方法操作简便，结果稳定可靠，可作为该制剂的一测多评定量分析方法。

满山红油液相色谱指纹特征的分析

目的:比较分析满山红油HPLC指纹特征,为满山红油的质量控制提供基础性研究资料。方法:采用Hypersil C18色谱柱,以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,流速:1.0mL.min-1,检测波长:210nm,测定了19批不同来源满山红油的HPLC-UV指纹图谱。用化学计量学的聚类分析和主成分分析方法结合相似度,比较分析全息指纹特征。结果:不同批次的满山红油按其指纹特征可分成两类。结论:牻牛儿酮峰对满山红油指纹特征类别的划分与指纹特征的相关性影响极大。

Cu^(2+)、Co^(2+)和Mg^(2+)对杜鹃素与DNA相互作用的影响

在pH7.4的缓冲溶液中,采用紫外-可见、荧光光谱法和DNA熔点实验并结合荧光探针亚甲基蓝(MB),研究杜鹃素与小牛胸腺DNA的结合模式以及Cu2+、Co2+和Mg2+分别对结合模式的影响。结果表明:杜鹃素主要以嵌插模式与DNA结合。3种金属离子均能不同程度影响杜鹃素的吸收光谱和增强DNA-MB复合物的荧光强度。随着体系中Cu2+浓度的增加,DNA-杜鹃素复合物的结合常数呈现出先减小后增加的趋势,增加Mg2+的用量则使复合物的结合常数影响先增强然后缓慢减弱,而Co2+浓度的增大对复合物的结合常数影响较小。由此得出,Cu2+、Co2+和Mg2+对该DNA-杜鹃素结合的影响分别取决于金属离子与杜鹃素的结合能力以及与DNA的碱基和磷酸基团间的结合程度。

杜鹃素通过增强Kv1.5和Kv2.1表达抑制尼古丁所致的肺动脉平滑肌细胞增殖

目的:研究杜鹃素(farrerol,Far)对尼古丁所致的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery vascular smooth muscle cells,PASMCs)增殖的作用,并进一步探讨其与电压依赖性钾通道(voltage-dependent potassium channels,Kv)1.5和Kv2.1的关系。方法:首先应用细胞计数法检测不同浓度尼古丁对PASMCs细胞数量的影响,筛选出最适的尼古丁浓度。将PASMCs随机分为5组,分别为:正常对照组、尼古丁(1μmol/L)组、尼古丁(1μmol/L)+低浓度(10^-6 mol/L)、中浓度(10^-5 mol/L)和高浓度(10^-4 mol/L)Far组。利用细胞凋亡试剂盒检测细胞caspase-3活性,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率。并进一步应用RT-qPCR和Western blot法分别检测各组细胞Kv1.5和Kv2.1及凋亡相关因子Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白水平。结果:细胞计数结果显示,1μmol/L尼古丁能最大限度地增加PASMCs的数量。1μmol/L尼古丁能显著降低PASMCs的caspase-3活性,并增强细胞活力(P<0.01)。杜鹃素(10^-6-10^-4 mol/L)可浓度依赖性地阻断尼古丁的作用。流式细胞术检测显示,与对照组相比,1μmol/L尼古丁可明显诱导PASMCs增殖,降低其凋亡率;而杜鹃素干预后,PASMCs的凋亡率显著高于尼古丁组(P<0.01)。RT-qPCR和Western blot检测结果显示,1μmol/L尼古丁显著抑制PASMCs Kv1.5、Kv2.1和Bax的表达,增加Bcl-2的表达;10^-5μmol/L杜鹃素可以显著逆转尼古丁对PASMCs的作用(P<0.01)。结论:杜鹃素能够对抗尼古丁所引起的大鼠PASMCs caspase-3和Bax抑制及Bcl-2增强,该作用与促进Kv1.5和Kv2.1表达有关。

芩暴红止咳口服液的质量标准研究

目的：完善和提高芩暴红止咳口服液的质量标准。方法：分别采用薄层色谱法和液相色谱法对满山红与暴马子皮进行定性研究；采用高效液相色谱法测定杜鹃素含量。结果：鉴别专属性强，含量测定杜鹃素在0．0123～0．3075μg范围内，线性关系良好，平均回收率98．13％（RSD1．04％）。结论：本方法快速简便、重现性好，可用于芩暴红止咳口服液的质量控制。

紫花杜鹃片中杜鹃素的HPLC法测定

目的:建立了HPLC法测定紫花杜鹃片中杜鹃素的含量。方法:采用Agilent C18色谱柱,以甲醇-0.1%磷酸溶液(57:43)为流动相,检测波长为297nm。结果:杜鹃素在0.0334～1.002μg范围内线性关系良好。回收率为96.7%,RSD=1.8%。结论:该方法结果准确,重现性好,可用于测定紫花杜鹃片中杜鹃素含量。

杜鹃素对H_2O_2诱导的内皮细胞凋亡的保护作用研究

目的研究杜鹃素对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的保护作用。方法采用M TT法检测细胞活力,相差显微镜和荧光显微镜观察细胞形态变化。结果采用5、10、20μg/m L浓度的杜鹃素处理细胞后,内皮细胞活性呈浓度依赖性增加,细胞存活率提高;与H2O2组相比,细胞皱缩明显减少。杜鹃素20μg/m L可抑制H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。结论杜鹃素具有抑制H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用。

杜鹃素通过降低Cx43的表达抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖

目的研究Cx43在杜鹃素抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖中的作用。方法体外培养原代大鼠VSMCs细胞,随机分为对照组、AngⅡ刺激组(模型组)、AngⅡ+杜鹃素组(给药组)。CCK-8法检测细胞活力,Ed U法检测细胞增殖活性,流式细胞术观察细胞周期,real-time PCR和Western blot法检测细胞中Cx43的表达。用si RNA干扰Cx43的表达并测定细胞Ed U结合率和细胞周期。结果浓度为60μmol·L^(-1)的杜鹃素可使AngⅡ诱导的大鼠VSMCs的细胞增殖活性和Ed U结合率均明显降低(P<0.05),并阻止VSMCs由G0/G1期向S期的转化。Real-time PCR和Western blot结果显示,与模型组比较,杜鹃素能明显降低Cx43的m RNA和蛋白表达水平(P<0.01)。用si RNA干扰Cx43的表达后,杜鹃素对AngⅡ诱导的VSMCs增殖的抑制作用明显减弱。结论杜鹃素可明显抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖,抑制VSMCs有丝分裂,使其停滞于G_0/G_1期,其作用可能与杜鹃素抑制Cx43的表达有关。

中药满山红有效成分杜鹃素在大鼠体内的排泄动力学研究

目的:研究中药满山红有效成分杜鹃素在大鼠体内的排泄动力学特征。方法:杜鹃素单剂量灌胃给予大鼠后,采用HPLC测定给药后不同时间段大鼠排泄的尿液、粪便样品中杜鹃素含量,绘制其累积排泄速率时间曲线,阐明杜鹃素在大鼠体内的排泄特征。结果:杜鹃素经原型药的排出量为10%左右,48 h内由尿中排泄的累积排泄率为2.87%;由粪便中排泄的累积排泄率为7.32%。结论:灌胃给药后,少部分杜鹃素以原型药通过粪便和尿液排泄,大部分杜鹃素在大鼠体内转化为其他形式,该研究为阐明杜鹃素体内代谢过程提供一定依据。

大鼠体内杜鹃素及其高活性新结构衍生物的药代动力学比较研究

目的建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定大鼠血浆中杜鹃素及其新结构衍生物2-(呋喃-2-基)-5,7-二羟基-6,8-二甲基-2,3-二氢苯并吡喃-4-酮(DJS-F)的含量,并应用于两者药代动力学特性比较研究,为以杜鹃素为先导物的新型高效衍生物设计合成与药效学等提供科学依据。方法 SD大鼠分别尾静脉注射给予杜鹃素及其衍生物DJS-F(18 mg/kg,36 mg/kg),于预定时间点眼静脉丛取血,杜鹃素及其衍生物互为内标,HPLC法测定血浆中杜鹃素及其衍生物F含量,色谱柱:oddysill C18(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相:甲醇-冰醋酸-水(65∶0.35∶34.65);体积流量:0.8 ml/min;紫外检测波长:217 nm。采用DAS2.1.1软件计算其药动学参数。结果所得不同时间点对应药物血浆浓度数据经软件自动拟合,得主要统计矩参数AUC(0-∞)分别为:杜鹃素2.311±0.778(18 mg/kg)、10.705±1.081(36 mg/kg)mg/L×h,DJS-F1.571±0.575(18 mg/kg)、7.130±2.232(36 mg/kg)mg/L×h;t1/2分别为:杜鹃素0.211±0.040(18 mg/kg)、0.097±0.023(36 mg/kg)h;DJS-F 0.216±0.125(18 mg/kg)、0.550±0.285(36mg/kg)h。结论本实验建立的HPLC法准确高效,具有良好的准确度、精密度及稳定性,可用于杜鹃素及其衍生物DJS-F血浆浓度测定。结果显示高剂量组DJS-F的AUC(0-∞)较其先导物杜鹃素显著下降,但半衰期t1/2显著延长,表观分布容积Vz显著提高,提示DJS-F在体内分布更加广泛。本实验所得数据可为杜鹃素的结构优化及药效学和毒理学评价提供参考。

HPLC波长切换法同时测定消痰益康(糖浆)中6种成分的含量

目的建立同时测定消痰益康(糖浆)中多成分的定量分析方法。方法采用HPLC波长切换法同时测定原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、金丝桃苷、槲皮素和杜鹃素的含量。色谱柱为Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm,5μm);以甲醇-0.04%冰醋酸溶液为流动相,按规定进行梯度洗脱;流速0.9 mL/min;检测波长分别为280 nm(原儿茶醛、儿茶素和表儿茶素)、360 nm(金丝桃苷和槲皮素)和299 nm(杜鹃素);柱温30℃。结果原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、金丝桃苷、槲皮素和杜鹃素分别在7.290~145.8、2.550~51.00、13.76~275.2、6.470~129.4、2.660~53.20、3.880~77.60μg/m L范围内与峰面积呈良好的线性关系;平均加样回收率及相应的RSD分别为98.68%(1.35%)、99.27%(1.17%)、97.05%(0.58%)、99.84%(1.19%)、97.89%(0.95%)、98.78%(1.13%)。结论该方法可用于消痰益康(糖浆)的含量测定及质量控制。

高效液相色谱法测定满山红软胶囊中杜鹃素含量

目的:建立高效液相色谱法测定满山红软胶囊中枉鹃素含量。方法:高效液相色谱法,流动相为甲醇一水(60:40);紫外检测波长297nm;流速10ml/min;柱温30℃。结果:在0．1040μg-0．5200μg范围内杜鹃素与峰面积线性关系良好,r=0．9999。结论:该方法快速,准确。

RP-HPLC法同时测定七味冬青叶散中苦杏仁苷、丹酚酸B和杜鹃素的含量

目的建立HPLC法同时测定七味冬青叶散中苦杏仁苷、丹酚酸B和杜鹃素的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法(HPLC),以SunfireC18(150mm×4.6mm,5μm)柱为色谱柱,流动相以甲醇-0.1%的磷酸溶液进行梯度洗脱,流速为1.0mL/min,以210、286、297nm为检测波长,柱温为30℃,进样量:10μL。结果苦杏仁苷、丹酚酸B和杜鹃素分别在40.720~895.84、38.960~857.12、1.9800~43.740μg/mL呈良好的线性关系,相关系数分别为0.9999、1.0000、0.9999,平均回收率分别为99.5%、100.6%、99.6%,RSD分别为1.5%、1.0%、1.6%(n=6)。结论所建立的方法可以应用于七味冬青叶散的质量控制。

杜鹃素下调JAK2/STAT3通路改善高盐致脑基底动脉炎症和肌张力异常的研究

目的基于Janus激酶2(JAK2)/转录激活子3(STAT3)通路探讨杜鹃素对高盐诱导的小鼠脑基底动脉炎症和肌张力异常的抑制作用及其分子机制。方法用喂养高盐饲料的方法建立高盐模型。将50只C57BL/6J小鼠随机分成正常组(正常饲养)、模型组(高盐饲料)、低剂量实验组(高盐饲料+灌胃12.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)杜鹃素)、中剂量实验组(高盐饲料+灌胃25 mg·kg^(-1)d^(-1)杜鹃素)、高剂量实验组(高盐饲料+灌胃50 mg·kg^(-1)d^(-1)杜鹃素),每组10只,干预12周。用微血管张力测定仪检测小鼠脑基底动脉对血管收缩剂的收缩反应;用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎性细胞因子水平;用蛋白质印迹法检测基底动脉组织JAK2/STAT3通路的相关蛋白表达。结果正常组、模型组和低、中、高剂量实验组脑基底动脉对60 mmol·L^(-1)氯化钾(KCl)的收缩幅度分别为(2.19±0.13)、(2.66±0.11)、(2.52±0.09)、(2.41±0.08)和(2.25±0.10)mN;对10^(-5)mol·L^(-1)血管加压素(AVP)的收缩幅度分别为(1.98±0.09)、(2.46±0.08)、(2.33±0.12)、(2.11±0.10)和(2.05±0.06)mN;对2.5 mmol·L^(-1)氯化钙(CaCl_(2))的收缩幅度分别为(1.77±0.08)、(2.09±0.09)、(2.03±0.08)、(1.94±0.05)和(1.86±0.06)mN;血清中白细胞介素(IL)-1β水平分别为(10.10±3.21)、(47.28±4.78)、(40.16±3.98)、(35.87±4.12)和(20.32±3.17)pg·mL^(-1);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平分别为(60.26±5.43)、(134.32±4.15)、(110.65±3.56)、(90.79±5.25)和(81.54±6.23)pg·mL^(-1);趋化因子配体3(CCL3)水平分别为(68.93±4.16)、(146.37±5.73)、(128.29±4.38)、(100.25±6.82)和(84.16±3.89)pg·mL^(-1);脑基底动脉组织JAK2表达水平分别为0.52±0.05、1.28±0.07、1.11±0.06、0.88±0.09和0.75±0.04;STAT3表达水平分别为0.58±0.07、1.93±0.10、1.62±0.04、1.34±0.06和0.88±0.09。模型组上述指标与正常组比较,均显著增高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。中、高剂量实验组上述指标与模型组比较,均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论杜鹃素可能通过下调JAK2/STAT3通路改善高盐致小鼠脑基底动脉炎症和肌张力异常。

杜鹃素对映体的分离及其在中药材中的含量测定

目的 建立杜鹃素对映体分离的HPLC方法,并应用于满山红和照山白药材中的对映体含量测定。方法 用HPLC对杜鹃素对映体进行拆分,优化手性柱种类、流动相比例、流速和柱温的色谱条件。对手性热力学拆分进行探讨,计算杜鹃素对映体在色谱柱分离的焓变、熵变、焓变差值和熵变差值等热力学参数。并在最佳分离条件测定了满山红和照山白2种药材中2个对映体的含量。结果 确定了杜鹃素的2个对映体的最佳分离条件:色谱柱为Chiralcel OJ-RH(4.6 mm×150 mm,5μm),乙腈-水(40∶60)为流动相等度洗脱,流速为0.5 mL·min^(–1),柱温为25℃,检测波长为295 nm。在最佳分离条件下,杜鹃素对映体的分离度达到1.5,表明杜鹃素的2个对映体能够完全分离。当柱温为20~35℃时,分离因子随着温度的升高呈降低趋势,2个对映体的lnα与1/T呈良好的线性关系,手性拆分过程受焓的控制。将所建立的杜鹃素对映体分离方法应用于中药材满山红、照山白中的杜鹃素对映体含量测定,杜鹃素的2个对映体线性范围分别为0.718~57.44μg·mL^(–1)和1.28~102.24μg·mL^(–1),在3个批次的满山红中杜鹃素的2个对映体的平均含量分别为0.228 2和0.466 2 mg·g^(–1);3个批次的照山白中杜鹃素的2个对映体的平均含量分别为0.416 8和0.707 3 mg·g^(–1)。结论 该方法简便高效,适用于中药中杜鹃素对映体的含量测定。