Arabidopsis tic62 trol Mutant Lacking Thylakoid- Bound Ferredoxin-NADP＋ Oxidoreductase Shows Distinct Metabolic Phenotype

Ferredoxin-NADP＋ oxidoreductase （FNR）, functioning in the last step of the photosynthetic electron transfer chain, exists both as a soluble protein in the chloroplast stroma and tightly attached to chloroplast membranes. Surface plasmon resonance assays showed that the two FNR isoforms, LFNR1 and LFNR2, are bound to the thylakoid membrane via the C-terminal domains of Tic62 and TROL proteins in a pH-dependent manner. The tic62 trol double mutants contained a reduced level of FNR, exclusively found in the soluble stroma. Although the mutant plants showed no visual phenotype or defects in the function of photosystems under any conditions studied, a low ratio of NADPH/NADP~ was detected. Since the CO2 fixation capacity did not differ between the tic62 trol plants and wild-type, it seems that the plants are able to funnel reducing power to most crucial reactions to ensure survival and fitness of the plants. However, the activity of malate dehydrogenase was down-regulated in the mutant plants. Apparently, the plastid metabolism is able to cope with substantial changes in directing the electrons from the light reactions to stromal metabolism and thus only few differences are visible in steady-state metabolite pool sizes of the tic62 trol plants.

模式蓝藻FNR蛋白的生物信息学及进化分析

FNR蛋白是蓝藻光能转换和能量代谢中的核心蛋白质,为了掌握该蛋白的生物信息学信息及其进化关系,选择具有研究和应用价值的7种模式蓝藻来源的FNR蛋白作为材料,以氨基酸序列为基础,采用ProtParam、Sompa、SWISS-MODEL及MEGA11等生物信息学工具对蓝藻FNR蛋白的结构、功能及进化关系进行分析。结果表明:蓝藻FNR蛋白均属于胞内表达的单亚基蛋白,无信号肽,无跨膜结构域。其氨基酸数目在370-440个之间,分子量在45 kD左右,理论等电点在5.5-6.0之间,不稳定性指数在40%左右,蛋白序列中存在保守的FAD及NADPH结合结构域及C末端的RWHVETY保守基序。蛋白的二级结构元件中,α-螺旋和β折叠比例在20%-30%之间,无规卷曲比例较高,普遍在47%左右。FNR蛋白的三级结构具有高度的结构相似性,蛋白质的N端普遍存在一段无序的无规卷曲结构,且暴露于蛋白质核心结构外侧。进化分析表明蓝藻FNR蛋白属于独立的进化分支,与高等植物来源的FNR蛋白的亲缘关系更近。本研究结果有助于深化对FNR蛋白的结构和功能的理解,同时也为FNR蛋白在藻类合成生物学的研究和应用提供参考。

高等植物铁氧还蛋白-NADP^+氧化还原酶研究进展

高等植物叶绿体定位的铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(LFNR)负责催化光合线性电子传递的最后一步反应,催化电子由还原态的铁氧还蛋白(Fd)传递给NADP+。LFNR分布在叶绿体的3个不同的组分中,即叶绿体基质中、类囊体膜上和叶绿体内膜上。最近的研究表明,大多数膜定位的LFNR并非光合作用所必需的,叶绿体基质中的LFNR足以维持光合作用的正常进行。叶绿体中的两个蛋白——Tic62和TROL作为LFNR的锚定蛋白,可以与LFNR在类囊体膜上形成高分子量的蛋白复合体。Tic62-LFNR复合体主要负责在夜间保护LFNR的活性,但它不直接在光合作用中起作用。然而,TROL-LFNR复合体对植物的光合作用有一定的影响。本文将概述植物LFNR的最新研究进展。

下调MTRR基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究

目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法（1）实验分为3组：下调MTRR基因表达的SKOV3/DDP细胞（SKOV3／DDP-MTRRi组）、转染阴性对照（NC）序列的SKOV3／DDP细胞（SKOV3／DDP．NC组，作为阴性对照）、未转染的SKOV3／DDP细胞（SKOV3／DDP组，作为空白对照）。不同浓度（0、1、2、4μg/ml）顺铂作用后，采用流式细胞仪检测3组细胞的凋亡率，免疫荧光法检测3组细胞的自噬现象，蛋白印迹（westernblot）法检测3组细胞中自噬标志分子自噬微管相关蛋白轻链3B（LC3B）、p62蛋白的表达，透射电镜观察3组细胞中自噬体的形成情况。（2）雷帕霉素诱导后SKOV3／DDP．MTRRi细胞自噬及凋亡情况变化的检测，实验分为4组，雷帕霉素组（5nmol/L雷帕霉素处理）、雷帕霉素＋顺铂组（5nmol/L雷帕霉素＋4肛咖l顺铂处理）、顺铂组（4μg/ml顺铂处理）、空白对照组，采用westernblot法检测4组细胞中自噬标志分子LC3B、p62蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测4组细胞的生存率，流式细胞仪检测g组细胞的凋亡率。（3）4μg／ml．铂作用48h后，westernblot法检测3组（即SKOV3／DDP-MTRRi组、SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组）细胞中凋亡相关因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）和Bcl-2家族以及磷脂酰肌醇3激酶（P13K），蛋白激酶B（Akt）自噬通路关键蛋白的表达。结果（1）不同浓度（0、1、2．4μg／ml）]顺铂组作用48h后，随着顺铂浓度的增加，3组细胞的凋亡逐渐增加，当顺铂浓度达到2μg／ml时，SKOV3／DDP．MTRRi组细胞的凋亡率[（26．2±1．4）％]明显高于SKOV3／DDP－NC组和SKOV3／DDP组[分别为（14．8±2．4）％、（14．2±214）％；P〈0．05]；免疫荧光法检测显示，随着顺铂浓度增加，SKOV3／DDP－MTRRi组细胞中LC3B蛋白在细胞质内聚集成团，明显多于SKOV3／DDP组和SKOV3／DDP－NC组；且与SKOV3／DDP组和SKOV3／DDP－NC组比较，SKOV3／DDP－MTRRi组细胞中LC3B蛋白表达水平明显降低（P〈0．05），p62蛋白表达水平明显升高（P〈0．05）；当顺铂浓度达到4μg／ml时，SKOV3／DDP组和SKOV3／DDP－NC组细胞内的细胞器结构完整，有少量自噬线粒体出现；而SKOV3／DDP－MTRRi组细胞内的细胞器结构消失，空泡明显增多，且没有观察到自噬体的形成。（2）与雷帕霉素组、顺铂组及空白对照组相比，雷帕霉素＋顺铂组SKOV3／DDP－MTRRi细胞中LC3B蛋白的表达水平（分别为1．43±0．04、1．37±0．11、1．11±0．09、1.72±0．08）明显升高（P〈0．05），p62蛋白的表达水平（分别为0．94±0．12、1．21±0．11、1．57±0．10、0．58±0．10）明显降低（P〈0．05）；与顺铂组比较，雷帕霉素＋顺铂组SKOV3／DDP-MTRRi细胞的生存率[分别为（0．62±0．03）％、（0．78±0．03）％]明显升高（P=0．018），凋亡率[分别为（59．0±3．9）％、（40．4±3．0）％]明显降低（P=0．019）。（3）4μg／ml顺铂处理48h后，与SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组比较，SKOV3／DDP-MTRRi组细胞中Bcl-2家族成员Bax蛋白的表达水平无明显变化（P=0．661），而Bcl-2蛋白的表达水平明显降低（P=0．030）；caspase家族成员caspase-3、caspase-7、caspase-9、多聚二磷酸腺苷-核糖聚合酶（PARP）蛋白的表达水平无明显变化（P〉0．05），而裂解的caspase-3、caspase-7、caspase-9、PARP蛋白的表达水平均明显升高（P〈0．05）。SKOV3／DDP．MTRRi组细胞中P13K／Akt自噬通路关键蛋白细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）蛋白的表达水平显著升高（P〈0．05），而第10号染色体同源丢失性磷酸酶．张力蛋白（PTEN）蛋白的表达水平显著下降（P〈0．05）。结论顺铂诱导可使MTRR基因下调的顺铂耐药卵巢癌细胞的凋亡增加、自噬减弱，其可能机制为通过调节caspase和Bcl一2凋亡家族蛋白以及P13K／Akt自噬通路中关键蛋白的表达，从而增加细胞对顺铂的敏感性。

蛋氨酸合成酶还原酶基因多态性与不明原因复发性流产的相关性

目的探讨蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR）A66G基因多态性与不明原因复发性流产（URSA）的相关性。方法采用PCR限制性片段长度多态性分析（PCR—RFLP）方法，对200对河南汉族URSA夫妇（URSA组）及76对有健康生育史的河南汉族夫妇（对照组）的基因型进行分析。结果（1）MTRRA66G等位基因频率：MTRRA66G等位基因A和G的频率URSA组分别为男性76．5％（153／200）、女性72．8％（146／200）；男性23．5％（47／200）、女性27．2％（54／200）；对照组分别为男性78．9％（60／76）、女性78．3％（59／76）；男性21．1％（16／76）、女性21．7％（16／76）。MTRRA66G等位基因频率在各组不同性别者及两组同性别者间比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）。（2）MTRRA66G基因型频率：MTRRA66G基因型AA、AG、GG频率URSA组分别为男性57．0％（114／200）、女性52．0％（104／200）；男性39．0％（78／200）、女性41．5％（83／200）；男性4．0％（8／200）、女性6．5％（13／200）；对照组分别为男性59．2％（45／76）、女性59．2％（50／76）；男性39．5％（30／76）、女性38．2％（29／76）；男性1．3％（1／76）、女性2．6％（2／76）。MTRRA66G基因型频率在各组不同性别者及两组同性别者间比较，差异也无统计学意义（P〉0．05）。（3）联合基因型频率：夫妇联合基因型GG＋GG、GG＋AG、GG＋AA、AG＋AG、AG＋AA、AA＋AA频率URSA组分别为1．0％（2／200）、2．5％（5／200）、6．0％（12／200）、20．0％（40／200）、38．O％（76／200）、32．5％（65／200）；对照组分别为0、1．3％（1／76）、2．6％（2／76）、17．1％（13／76）、42．1％（32／76）、36．8％（28／76）；两组夫妇联合基因型比较，差异也无统计学意义（P〉0．05）。结论MTRRA66G位点多态性与URSA的发生无明显相关性，不是URSA的遗传易感基因。

文心兰RFNR的克隆、亚细胞定位及其与LFNR不同的胁迫响应机制研究

以‘小樱桃’文心兰为材料克隆了铁氧还蛋白氧化还原酶(FNR)两种类型基因RFNR(Root-type Ferredoxin-NADP+oxidoreductase)和LFNR(Leaf-type Ferredoxin-NADP+oxidoreductase)。生物信息学分析表明,RFNR与LFNR都属于FNR-like超家族,具有黄素腺嘌呤二核苷酸(flavinadenine dinucleotide,FAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)功能结合域,在进化过程中比较保守;两种类型的FNR在氨基酸组成、蛋白结构和构型方面存在明显差异,RFNR比LFNR有更强的保守性。FNR蛋白亚细胞定位结果表明文心兰FNR蛋白都定位于叶绿体。实时荧光定量PCR分析表明,LFNR和RFNR具有器官表达特异性:LFNR更多地在叶中表达,RFNR更多地在根中表达;在软腐病胁迫下LFNR下调响应,RFNR上调响应;两种类型的FNR在盐胁迫以及高温胁迫处理时上调响应,但RFNR响应较快且强度更大;LFNR和RFNR在水杨酸(salicylicacid,SA)处理时轻微波动,茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理时呈现单峰反应。文心兰两种类型的FNR基因在不同类型的胁迫中显示相似的和有区别的表达特性,表明其具有不同的胁迫响应分子机理。

下调MTRR基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌SKOV3细胞体内外生物学特性的影响

目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）SKOV3／DDP细胞体内外生物学特性的影响。方法（1）MTRR基因下调的SKOV3／DDP细胞系的构建及鉴定：设计4个针对MTRR基因不同靶序列的短发夹状RNA（shRNA），分别为U6-GFP-Neo-homo-1106、U6-GFP—Neo-homo-1931、U6-GFP—Neo-homo-419、U6-GFP-Neo—homo-1460，蛋白印迹（western blot）法筛选干扰效果最好的针对MTRR基因的shRNA连接至pSicoR质粒，建立重组慢病毒干扰载体（即pSicoR-1106）并感染SKOV3／DDP细胞，流式细胞仪筛选稳定转染的细胞，逆转录（RT）-PCR技术及western blot法验证转染后细胞中MTRR mRNA和蛋白的表达。（2）体外实验：实验分为3组，重组慢病毒干扰载体pSicoR-1106、阴性对照质粒pSicoR-NC及包装质粒采用脂质体法分别转染肾上皮细胞系293T细胞，所得病毒上清液感染SKOV3／DDP细胞，所得感染后细胞即为下调MTRR基因的SKOV3／DDP-MTRRi细胞（SKOV3／DDP-MTRRi组）以及阴性对照SKOV3／DDP-NC细胞（SKOV3／DDP-NC组，作为阴性对照）和未转染的SKOV3／DDP细胞（SKOV3／DDP组，作为空白对照）。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定3组细胞的生长情况及其对顺铂的耐药性[以50％抑制浓度（IC50）表示]；不同浓度（0、1、2、4μg／m1）的顺铂作用后，克隆形成实验检测3组细胞的克隆形成情况，流式细胞仪检测3组细胞的细胞周期比例。（3）体内实验：将上述3组细胞接种于裸鼠的腹股沟皮下，建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。以2．5mg/kg顺铂腹腔注射（每2天1次，共21次）后，观察3组（每组8只）裸鼠移植瘤的生长情况，采用免疫组化SP法检测3组裸鼠移植瘤组织中MTRR、细胞增殖相关核抗原（Ki-67）蛋白的表达。结果（1western blot法筛选的干扰效果最好的针对MTRR基因的shRNA为U6-GFP-Neo-homo-1106，以此建立重组慢病毒干扰载体pSicoR-1106，转染SKOV3／DDP细胞后，其MTRRmRNA和蛋白的表达明显减弱，证实下调MTRR基因表达的SKOV3／DDP细胞系构建成功。（2）MTT比色法检测显示，第5天开始，SKOV3／DDP—MTRRi组细胞的生长速度明显慢于SKOV3/DDP-NC组和SKOV3／DDP组（P〈0．05）；SKOV3／DDP—MTRRi组、SKOV3／DDP-NC组、SKOV3/DDP组细胞对顺铂的IC50分别为4．01、7．90、8．91μg／ml，SKOV3／DDP—MTRRi组明显低于SKOV3／DDP-NC组和SKOV3／DDP组（P〈0．05）。不同浓度（0、1、2、4μg／m1）的顺铂作用后，克隆形成实验检测显示，各浓度下SKOV3／DDP-MTRRi组克隆形成个数均明显少于SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组（P〈0．05）；流式细胞仪检测显示，当顺铂浓度为4μg／ml时，SKOV3／DDP．MTRRi组细胞的GJG。期比例为（72．8±5．0）％，明显高于SKOV3／DDP-NC组及SKOV3／DDP组[分别为（64．4±2．5）％、（64．3±3．0）％，P〈0．05]。（3）裸鼠腹腔内注射顺铂6周后，SKOV3／DDP-MTRRi组、SKOV3／DDP—NC组、SKOV3／DDP组裸鼠移植瘤的体积分别为（97±32）、（168±45）、（173±32）mm^3，移植瘤质量分别为（0．36±0．17）、（1．08±0．17）、（1．11±0．20）g，SKOV3／DDP-MTRRi组上述指标均明显低于SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组（P〈0．05）。3组移植瘤组织中，MTRR蛋白的阳性表达率分别为2／8、5／8、7／8，Ki-67蛋白的阳性表达率分别为118、6／8、7／8，SKOV3／DDP—MTRRi组上述指标均明显低于SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组（P〈0．05）。结论MTRR基因表达下调后在体内外均能降低顺铂耐药的卵巢癌SKOV3／DDP细胞的增殖能力，并增加其对顺铂的敏感性。