创伤弧菌铁调基因fur的原核表达及多克隆抗体制备

应用PCR方法克隆了创伤弧菌Vibrio vulnificus FJ03-X2株的铁调基因fur(Ferric uptake regulator),该基因片段大小为450bp,编码149个氨基酸;以pET32a为表达载体,构建了原核表达质粒pET32a-FUR,表达质粒测序结果表明目的基因与GenBank中报道的创伤弧菌fur基因的同源性达98%以上;诱导表达获得可溶性的重组表达蛋白rFUR。镍离子金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化rFUR,SDS-PAGE电泳分析其分子量约33kD。以纯化后的融合蛋白rFUR为抗原,4次免疫SD大鼠,制备抗rFUR蛋白大鼠多克隆抗体。用ELISA方法检测鼠多克隆抗体的效价达到1∶256 000,表明融合蛋白rFUR具有良好的免疫原性。

铁摄取调节蛋白Fur功能和作用模式的研究进展

铁是大多数生物必需的微量元素,在健康和疾病,尤其是宿主-病原菌互作过程中发挥着至关重要的作用.细菌胞内铁离子浓度的高低不仅是调节自身高亲和力铁运输系统表达的信号,更是病原菌产生毒素和其他必要毒力因子的关键调控因素.而另一方面,超负荷的铁也会导致致命的细胞毒性.因此,生物体内铁稳态的维持受到严格控制,其中以铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)的作用最为显著,其调控网络涵盖了细菌生命活动的各个方面.本综述将基于Fur的生物学功能,围绕其家族分类、结构特点和差异、调控网络和调控机制等方面进行总结和分析,以期为Fur和铁稳态调节等研究提供参考.

施氏假单胞菌A1501铁吸收调节蛋白Fur的表达特性与功能鉴定

铁是细胞生理代谢的重要金属元素,是多种氧化还原酶类、过氧化物酶类的重要组成部分。革兰氏阴性菌中,胞内铁转运、储存和利用主要由铁吸收调节蛋白Fur(ferric uptake regulator)调控。水稻根际联合固氮菌--施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501基因组中含有一个fur同源基因,但其具体功能尚不清楚。比较了A1501中fur基因及其编码蛋白的序列特征,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative,qRT-PCR)和Western blotting杂交方法测定了fur基因和Fur蛋白的表达特性,结果发现fur基因表达水平与环境中铁浓度呈负相关,在铁限制条件下高表达,铁过量条件下表达受抑制。构建了fur基因突变株和功能回补株,表型测定发现fur突变影响了A1501的碳源代谢谱,并导致A1501对过氧化氢胁迫敏感。胞内铁含量测定表明,fur突变株内的铁含量为野生型的1.3倍,进一步qRT-PCR测定表明fur突变影响了铁离子转运系统及过氧化物酶编码基因的表达。研究结果为解析根际微生物胞内铁平衡调节及根际环境适应机制奠定了理论基础。

铜绿假单胞菌fur基因缺失突变株的构建及其表型分析

铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)是控制铜绿假单胞菌铁代谢和毒力的关键调节因子。许多课题组尝试构建铜绿假单胞菌fur的缺失突变株均失败,因此铜绿假单胞菌的fur一直被认为是必需基因,这导致其生物学功能一直未得到全面的解析。【目的】构建铜绿假单胞菌fur的缺失突变株,并对该突变株的表型进行分析。【方法】以铜绿假单胞菌PAO1为亲本菌株,通过同源重组的方法构建fur缺失突变株,研究该基因对铜绿假单胞菌生长、铁载体生物合成、抗氧胁迫能力、鞭毛形成、生物被膜形成和毒力等的影响。同时,通过遗传分析对fur缺失突变株生长缺陷表型的原因进行探究。【结果】本研究成功构建了铜绿假单胞菌fur基因的缺失突变株,发现缺失突变fur极大地限制了铜绿假单胞菌的生长能力,并降低了该菌对限铁环境的生长适应性,但不影响该菌对高铁环境的生长适应性。铜绿假单胞菌Δfur的这种生长缺陷表型是细胞生长增殖变慢造成的,而不是诱导细胞死亡引起的。然而,其他异源的fur基因能完全互补Δfur的这种生长缺陷表型,暗示铜绿假单胞菌的Fur蛋白在功能上不存在独特性。尽管Fur与毒素-抗毒素系统PacTA存在功能关联性,但是铜绿假单胞菌Δfur的这种生长缺陷表型却与PacT毒素无关。除了影响铜绿假单胞菌的生长表型,缺失突变fur还使铜绿假单胞菌丧失了对铁载体生物合成的抑制作用,导致该菌对H_(2)O_(2)更敏感并丧失了鞭毛的形成能力,同时降低了该菌对大蜡螟幼虫的毒力。此外,缺失突变fur还显著提升了铜绿假单胞菌的胞内环二鸟苷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)水平,从而诱导pelF和pslA基因的表达,进而促进铜绿假单胞菌生物被膜的形成。【结论】fur是可以缺失的非必需基因,在铜绿假单胞菌的正常生长、铁载体生物合成、抗氧胁迫能力、鞭毛形成、生物被膜形成和毒力等方面都发挥着十分重要的作用,这为针对铜绿假单胞菌的疫苗和抗菌药物开发奠定了基础。

杜梨根系铁吸收关键基因生物信息学分析及缺铁胁迫对其表达的影响

为了探究缺铁胁迫对杜梨根系铁吸收关键基因表达的影响,对杜梨根系铁吸收关键基因三价铁还原酶(Pb FRO2)基因和铁转运蛋白(Pb IRT1)基因的氨基酸序列进行了多重序列比对和进化树分析;采用改良的Hoagland营养液水培杜梨的方法,研究了缺铁胁迫对杜梨根系Pb FRO2和Pb IRT1基因相对表达量以及根系铁和锌含量的影响。结果表明,Pb FRO2蛋白具有还原酶特性,Pb IRT1蛋白属于二价金属离子转运蛋白家族—ZIP家族;缺铁胁迫9 d内,杜梨根系Pb FRO2和Pb IRT1的表达量整体上呈现出先升高后降低的趋势,胁迫3 d表达量达到最高点且与对照(加FeEDTA)差异显著;缺铁胁迫30 d,杜梨根系中铁含量比对照降低77.46%,而锌含量提高1 139.40%。综上可知,缺铁胁迫可诱导杜梨根系铁吸收关键基因表达量升高,进而促进二价金属离子转运蛋白的活性提高。

铜绿假单胞菌铁与群体感应系统的调节

目的分析总结铜绿假单胞菌铁调节机理及其与群体感应系统之间的调节关系。方法汇总实验室有关铁调节和群体感应系统的研究结果,并结合相关文献资料进行分析总结。结果铜绿假单胞菌可以通过多种途径吸收利用不同来源或状态的铁源,在各种铁吸收途径中以铁载体介导途径尤为重要。Fur蛋白作为调节中心,与小RNA和ECF sigma因子共同对铁平衡进行精巧调节,而铁调节和群体感应系统相互影响,共同调节着相关基因的表达。结论铜绿假单胞菌中铁和群体感应系统协同作用,形成一个复杂的全局性网络,调节菌体毒性因子的表达等多种生理过程,影响着细菌感染的进程。

铁吸收调节蛋白的研究现状

铁吸收调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)是多种微生物菌体内调控铁的一种蛋白质,它编码一个铁感应器以及转录调控因子,可以根据细胞内Fe2+的浓度,氧化应激以及毒性来调控铁载体合成相关基因的表达。研究发现Fur不仅调节与铁相关的物质代谢,也与其他的物质代谢有着紧密的联系。综合国内外研究进展介绍了Fur的结构与功能,阐述了Fur在生物冶金、农业、医药等方面的研究进展,并对其应用前景以及研究趋势进行了展望。

细菌感应金属信号及调节金属稳态的研究进展

铁、锰、锌等微量金属元素是几乎所有细菌生存所必需的,在各种关键代谢过程中起着重要的辅助因子作用。例如,铁缺乏的条件下细菌很难维持正常的生理活动,但是过量的铁也会通过Fenton反应催化活性氧物质(如羟基自由基)的形成从而对细菌造成损伤。针对环境中不断变化的金属离子可用性,结合内环境的变化,细菌进化出了以各金属离子吸收调节家族蛋白为核心的多种调控机制。这些调控元件大多是将基因调控与金属浓度相偶联的全局性转录因子家族,也是细菌金属代谢中最重要的调节因子。以细菌的铁稳态为例介绍了调控金属离子稳态的经典模式,同时对不同内外环境条件下的铁平衡和铁运输进行了详细介绍;以几种典型金属元素的胞内稳态为例介绍了目前三种已知金属感应调节器的类型,为细菌的某些未知金属稳态及其他微生物的金属传感器及金属稳态的研究提供了参考。

铁摄取调节子在细菌铁离子代谢中的调节及其机制

铁离子是大多数细菌生存所必需的营养物质,但是过多的铁离子通过芬顿反应产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)对细菌造成损伤。因此,细菌必须严格控制体内铁离子浓度。铁摄取调节子(ferric uptake regulator,Fur)是细菌铁离子代谢中最重要的调节子。Fur通过抑制或者激活基因的转录,来调节与铁摄取、利用和储存相关的基因,维持胞内铁离子浓度动态平衡。此外,Fur还参与细菌的氧化应激、抗酸能力、毒力和能量代谢等多种生物过程的调节。本文对Fur参与的生物过程及调节机制进行介绍,以期为进一步研究其他细菌Fur的调节机制,以及Fur在细菌应对环境变化中所起作用提供参考。

鱼腥藻铁吸收调节蛋白基因(alr0957)的克隆和表达

依据CyanoBase提供的鱼腥藻PCC7120 furC基因(alr0957)的序列信息设计了一对特异性引物,用Touch-down PCR的方法从基因组DNA中扩增得到大小约450bp的目的片段.通过TA克隆的方法将该片段连接到pMD18-T载体上筛选出重组质粒pMD18-T-fur,然后进行双酶切,纯化furC基因,再连接到原核表达载体pET-28a(+)上,转化表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,对阳性菌株进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白.结果表明:在25℃条件下经1mmol/L IPTG诱导20h,融合蛋白被成功表达,其分子量约为19 000,为进一步纯化蛋白和对基因的调控功能方面研究奠定了基础.

胃癌相关的幽门螺杆菌铁摄取调节蛋白基因多态性及进化分析

目的:探寻幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和进化分型与胃癌的相关性。方法:选取2011-2018年青岛市市立医院保存的150株Hp(胃癌来源59株和胃炎来源91株),运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增fur基因,并进行一代测序及SNP分析。通过NCBI数据库下载226株东亚亚群Hp菌株fur基因序列,应用MEGA 5.0软件分析SNP并构建fur基因Neighbour-Joining系统进化树,建立进化分型。结果:98.7%(148/150)Hp菌株fur基因PCR扩增阳性。序列分析发现fur基因351位点存在碱基A→G的同义SNP(SNP A351G),胃癌来源的菌株中G等位基因的变异频率明显高于胃炎来源的菌株,差异有统计学意义(χ2=5.161,P=0.023);携带该等位基因的菌株发生胃癌风险明显升高(OR=2.4)。在东亚Hp fur基因的Neighbour-Joining系统进化树中,依据进化距离将东亚Hp菌株分为Ⅰ型和Ⅱ型两个亚型,fur基因进化Ⅰ型中的胃癌来源Hp菌株比例明显高于Ⅱ型,差异有统计学意义(χ2=41.8,P=9.9×10-11);感染furⅠ型Hp的患者发生胃癌的风险显著升高(OR=4.7)。结论:携带fur SNP A351G的Hp菌株导致胃癌发生风险显著升高,fur基因进化Ⅰ型与胃癌发生风险具有一定相关性。

铜绿假单胞菌铁摄取调节子Fur诱导表达突变株构建及表型分析

铁摄取调节子(Ferric uptake regulator,Fur)是细菌控制细胞内铁平衡的一类重要的调节子。铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的fur为必需基因,不能直接敲除。文中通过构建诱导型缺失突变株Δfur/att B::PBAD-fur,来研究该基因对铜绿假单胞菌的生长、生物被膜形成、运动能力和抗氧应激能力等方面的影响。结果表明,当Fur低表达时,铜绿假单胞菌在高铁和低铁环境中出现了生长阻滞的现象;低表达Fur的铜绿假单胞菌抵抗H2O2的能力降低,形成生物被膜的能力减弱,游动、颤动(Twitching)和丛集(Swarming)运动能力也出现了减弱的现象。Fur的表达直接影响铜绿假单胞菌荧光嗜铁素的产量。在铜绿假单胞菌体内表达来自格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌Fur超级家族中的蛋白,可以部分恢复铜绿假单胞菌荧光嗜铁素的产量。由此说明,Fur对铜绿假单胞菌的生长、生物被膜形成、抗氧应激能力和运动能力方面都起着至关重要的作用。本研究为铜绿假单胞菌的防治提供理论指导。

猪B型多杀性巴氏杆菌铁摄取调节基因Fur的生物信息分析及其原核表达

目的对猪B型多杀性巴氏杆菌铁摄取调节基因Fur进行生物信息分析,并检测原核表达产物的抗原性。方法以猪B型多杀性巴氏杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增Fur基因,克隆至载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-Fur。利用生物信息学方法结合网络数据库测序分析Fur基因同源性、蛋白质理化特性、蛋白质结构并进行同源建模。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经透析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组质粒p GEX-6p-1-Fur经双酶切鉴定构建正确。Fur基因全长432 bp,编码144个氨基酸,与禽Pm70菌株的Fur基因同源性达99.8%,与嗜血杆菌属亲缘较近;Fur蛋白空间结构与铁吸收调节蛋白2w57.1.A相似性较高,Fur蛋白为酸性脂蛋白,Fur蛋白二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,107-117位氨基酸区域作为抗原表位可能性较大,且Fur无跨膜区与信号肽,是相对成熟稳定的蛋白。以2w57.1.A为模板构建了可靠的三维结构分子模型。重组蛋白GST-Fur相对分子质量约44 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的33%,纯化后纯度达92%,重组蛋白GST-Fur可与多杀性巴氏杆菌制备的血清发生特异性结合。结论于E.coli中成功表达了重组蛋白GST-Fur,构建了可靠的三维结构模型,为进一步研究Fur蛋白功能及毒力作用机制奠定了基础。

金黄色葡萄球菌fur基因缺失株构建及其生物学特性研究

目的构建金黄色葡萄球菌Newman株fur基因缺失株,对其体外增殖、细胞侵袭及溶血活性特征变化进行研究,为通过封闭Fur蛋白表达治疗金黄色葡萄球菌感染提供新的实验依据。方法采用Gateway同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman株fur基因缺失株,采用分光光度法检测其体外增殖活性变化;采用万古霉素保护试验检测其对A 549肺腺癌细胞株侵袭力的变化;观察其在血琼脂培养基上的溶血活性变化;采用实时荧光定量PCR检测fur缺失株α溶血素(hla)基因mRNA表达水平变化。结果成功构建金黄色葡萄球菌Newman株fur基因缺失株并通过PCR方法和测序方法验证。与Newman野生株相比,同一时间点侵入A 549肺腺癌细胞株内fur缺失株菌量(2 950CFUs/ml)显著少于野生株(20 100CFUs/ml,P<0.01),缺失株体外增殖活性及溶血活性显著减弱,且hla基因mRNA相对表达量(0.067)显著低于野生株(0.270)(P<0.05)。结论金黄色葡萄球菌fur缺失株在富铁条件下的增殖活性、细胞侵袭力及溶血活性均显著降低,对环境铁浓度感应及利用能力明显降低,Fur蛋白可能作为抗金黄色葡萄球菌感染治疗的新靶点。

细菌铁摄取调节蛋白Fur的研究进展

铁摄取调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)是绝大多数细菌中存在的一种全局调控转录因子。其利用Fe2+作为辅助因子,通过调控铁摄取和储存系统来维持细菌内的铁稳态。此外,越来越多的研究表明Fur还可以直接或间接的参与多种代谢途径,帮助细菌有效地应对外部环境和压力,并在细菌侵染定植中发挥重要作用。本文对Fur蛋白的结构,调控机制以及在常见细菌中功能的研究进展进行阐述。

铁对藻类生长及藻毒素合成影响研究进展

铁作为藻类生长发育所必需的矿质营养元素之一,在藻类光合作用、呼吸作用、固氮作用、蛋白质与核酸合成等生理代谢过程中发挥着极为重要的作用.鉴于水体中不同形态铁可被藻类吸收利用,本文综述了铁在水体中的存在形态和循环途径、藻类吸收铁的机理、铁对藻类生长及藻毒素合成的影响,总结了有关微囊藻毒素合成基因及其在铁限制条件下的表达,并对今后铁蛋白基因调控藻类富营养化的研究方向进行了展望,以期为水体富营养化修复技术提供参考.

铁调蛋白的功能及应用前景

铁调蛋白不仅可以调节微生物细胞内与金属内稳态直接相关的基因表达,还可以调节细胞代谢以减少细胞对供应短缺的金属的需求。目前,对铁调蛋白的研究已有一定的成果,部分铁调蛋白的结合位点的氨基酸残基及调节机制都被确定。本综述总结了铁调蛋白的金属转录调节因子,介绍了关于铁调蛋白基因表达机制的研究现状以及铁调蛋白在不同领域的功能,此外还介绍了最新铁调蛋白调控微生物细胞金属响应结合位点方面的最新进展,以及在生物冶金与其他方面的应用前景。