绵羊fertilin β基因编码区的钓取与结构分析

Fertilin β与精卵的结合和融合有密切关系。为探讨fertilin β蛋白在绵羊受精过程中的作用机理,采用RACE技术,首次钓取了该基因的编码区。结果绵羊fertilin β基因的编码区cDNA全长为2,217bp。同源性分析显示,绵羊的fertilin β氨基酸序列与牛、猪和人的fertilin β具有79.4%、66.7%和58.1%的同源性。系统发育分析表明,绵羊fertilin β与牛属于同一分支,并且也显示了绵羊和牛分类地位最近,这和传统的分类一致。Fertilin β蛋白结构域分析显示,绵羊fertilin β去整合素识别序列为TDE,与牛的序列相同。除了上述三肽序列外,紧随X-D/E-E的ECD保守序列,从而形成了X-D/E-ECD五肽保守序列,在绵羊fertilin β中该五肽序列为TDECE。

猴Fertilinβ氨基端93肽基因的克隆及其在大肠杆菌中表达

Fertilin是一种异二聚体精子表面蛋白。业已证明,它在精卵反应中起着重要作用。成熟的Fertilinβ亚基的氨基端93肽含有与整联蛋白结合的整联蛋白配体区。该整联蛋白配体区与蛇毒整联蛋白配体区高度同源,它们能与细胞表面的整联蛋白相结合。 在此我们报道猴成熟Fertilinβ氨基端93肽基因的克隆和在大肠杆菌中的表达。用RT-PCR方法获得mFβNTP93基因,克隆人表达载体pT7-7/hCGβ的EcoRI和BamHI位点,该基因与hCGβ基因一起表达融合蛋白mFβNTP93-hCGβ,Western blotting结果显示,融合蛋白的表观分子量为33kDa,能与抗hCG抗体专一性结合。由于mFβNTP93基因与hCGβ基因相连,因此我们推测,mFβNTP93基因已获得表达。

精子头后部质膜融合蛋白fertilin的研究进展

精子头后部(或赤道区)表面fertilin糖蛋白由相关的两个跨膜亚基α和β构成异二体形式。这两个亚基前体均含有金属蛋白酶区(met-alloprotease domain)和整联蛋白配体区(disin-tegrin domain),属于ADAMs gene家族。α和β前体分别在睾丸和附睾中从上述两区域连接处水解后,得到成熟型亚基。受精时,穿过透明带的顶体反应后精子借助β亚基的disintegrin肽段与卵母细胞表面的整联蛋白结合,同时fertilin结构发生变化,暴露出α亚基上潜在的融合肽段(90—111aa),并介导精子与卵母细胞发生质膜融合,最终完成受精过程。

精子膜蛋白受精素(Fertilin)研究进展

精子膜蛋白受精素(Fertilin)是参与精卵质膜间相互作用最有特征性的候选分子之一。受精素由α、β两个亚基组成,为精子表面的异二聚体跨膜糖蛋白。fertilin-α(Fα)、Fertilin-β(Fβ)可能在精子发生、精子成熟、精子获能及精卵结合和融合中发挥重要作用。

鼠受精素β亚单位胞外区的真核表达质粒pSG.SS.YL-F_β.ECD的构建与表达

目的构建表达鼠受精素β(Fβ)胞外区的真核表达重组质粒pSG.SS.YL-Fβ.ECD并对其表达进行检测。方法应用PCR方法获得鼠Fβ的cDNA片断,将其插入pSG.SS.YL中,经酶切鉴定正确后转染HEK293细胞,并利用间接免疫荧光结合激光共聚焦技术对Fβ的表达进行检测。结果构建成功后的pSG.SS.YL-Fβ.ECD在HEK293细胞中能够表达Fβ。结论Fβ在真核细胞中的成功表达为后续研究Fβ的高表达对受精过程的影响奠定了基础。

精子抗原受精素β的研究进展

受精素 β是精子表面特异性抗原 ,主要通过其去整合素结构域在受精过程中发挥重要的生理功能。本文对受精素β的蛋白质结构、定位及在受精过程中的作用进行了综述 ,并提出受精素 β可作为免疫避孕疫苗研究中重要的靶分子 。

表达小鼠精子受精素β胞外区减毒沙门菌疫苗株的构建

目的 :构建表达鼠精子抗原受精素 β亚单位 (Fβ)胞外区的可口服减毒沙门菌活疫苗株。 方法 :设计一对引物 ,应用PCR方法获得Fβ 胞外区cDNA片断 ,将其插入表达载体pYA3 14 9中 ,构建重组质粒pFEC ,将该重组质粒转入鼠沙门菌疫苗株X4 63 2 ,获得杂合菌株X4 63 2 (pFEC)。该重组菌口服免疫雌鼠 ,通过ELISA方法检测其诱导雌鼠血清IgG抗体和阴道分泌物IgA抗体滴度变化。 结果 :此疫苗株X4 63 2 (pFEC)可稳定表达被Fβ 抗体识别的重组Fβ 胞外区蛋白 ,口服该菌株不但可激发雌鼠产生高水平血清抗重组Fβ 蛋白IgG抗体 ,而且在阴道分泌物中可出现一定程度抗重组Fβ 蛋白IgA抗体 ,无明显毒性作用。 结论 :X4 63 2 (pFEC)疫苗株的构建为研究以Fβ 为靶抗原的精子抗原避孕疫苗打下了基础。

表达人受精素β去整合素结构域的重组沙门菌疫苗株的构建

目的 构建表达人受精素 β去整合素结构域的重组沙门菌疫苗株。 方法 应用PCR方法获得人受精素 β去整合素结构域的cDNA片断 ,将其插入高拷贝表达载体pYA3 3 3 9中 ,构建重组质粒pYA3 3 3 9 hf2 79,将该重组质粒转入鼠沙门菌疫苗株X45 5 0 ,获得重组菌株X45 5 0 (pYA3 3 3 9 hf2 79)。结果 该重组疫苗株可稳定表达能被抗人受精素 β多克隆抗体识别的重组蛋白HF93 ,其分子量约为 16× 10 3。结论 该疫苗株的构建为进一步研究以人受精素

小鼠受精素β亚单位真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL-F_β构建及在HEK293细胞中的表达分析

目的:构建表达小鼠受精素β去整合素结构域(Fβ)的真核表达重组载体pSG.SS.C3d3.YL-Fβ,并对其在HEK293细胞中的表达进行分析。方法:应用PCR方法获得Fβ的cDNA片断,将其插入pSG.SS.C3d3.YL中,经酶切鉴定正确后转染HEK293细胞,并利用间接免疫荧光结合激光共聚焦技术、Western印迹技术、免疫组织化学染色技术及流式细胞仪检测技术对Fβ的表达进行检测。结果:成功构建了Fβ的真核表达重组载体pSG.SS.C3d3.YL-Fβ,该重组载体在HEK293细胞中能够表达Fβ。结论:Fβ在真核细胞中的成功表达为后续研究Fβ的高表达对受精过程的影响奠定了基础。

受精蛋白β在人精子表面的免疫组织化学定位

以人受精蛋白β整联蛋白配体区为抗原免疫小鼠并制备单抗,应用免疫组化方法研究了受精蛋白β在不同状态人精子表面的分布规律。结果表明受精蛋白β散在分布于新鲜人精子的头部,获能后则向顶体区集中,顶体反应过程中同时出现表达量及分布位置的急剧变化,最后定位于精子头后部。其分布规律与动物受精蛋白有所不同。受精蛋白β在人精子表面分布的位置及其变化揭示其在受精过程中的重要作用。

受精素在精卵结合与融合中作用的研究进展

哺乳动物的受精过程是一个十分复杂的动态过程,在这一过程中,精子表面的膜蛋白发挥着重要作用。受精素α和β是精子表面的膜蛋白,也是精子表面的特异性抗原。研究发现小鼠和人的受精素基因分别位于5号和8号染色体,只在睾丸中特异性表达。受精素β在精子成熟前分布于整个头部,要在附睾成熟后受精素只分布于头后部区域。受精素β基因敲除的小鼠精子与卵细胞的结合能力明显下降,特异性抗体的抑制作用及合成肽竞争性抑制作用可以抑制精卵结合。受精素β通过去整合素与卵细胞表面的整合素结合,在精卵细胞的结合中发挥着重要的作用。精卵质膜的融合主要是由Izumo蛋白完成。

精子膜表面糖蛋白受精素β的研究进展

作为少数几种在精卵质膜结合与融合中发挥重要作用的精子膜表面蛋白之一,受精素β是多种哺乳动物精子均具有的重要物质。它是ADAMs家族的一种融合蛋白,具有ADAMs家族的完整结构域;同时,因其结构域中去整合素区域的结构特点在精卵质膜结合与融合过程中扮演着重要角色,而被认为是一种重要的疫苗靶抗原。

ADAMs与哺乳动物受精

ADAMs是近几年发现的一类具有多个结构区和广泛生物学功能的糖蛋白 ,它们在哺乳动物受精中的作用日益得到实验结果的支持 ,本文简要总结了近几年ADAMs在哺乳动物受精中作用的研究进展。

一种新的混合斑精子分离方法

制备了精子表面膜抗原受精素β蛋白（Fertilinβ）的特异性抗体,通过抗原-抗体反应和抗体固相偶联技术,将抗体连接到琼脂糖球珠上,建立了混合斑精子分离纯化的新方法.首先,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码人受精素β蛋白第341~373位氨基酸的基因序列,构建PGEX-4T-1/Fertilinβ原核表达质粒;其次,诱导表达GST-Fertilinβ融合蛋白,制备受精素β蛋白多克隆抗体,免疫荧光检测结果表明,受精素β蛋白定位于精子的头后部,并且阴道上皮细胞没有受精素β蛋白的表达;最后,将受精素β抗体与ProteinA琼脂糖球珠连接构建固相抗体系统,将精子吸附于表面,可从混合斑（精子与阴道上皮细胞混合液）中分离纯化精子.本文为性犯罪案件侦破提供了新的方法.

真核表达质粒pSG.SS.C3d3.YL.F_(β.ECD)免疫避孕效应研究

目的研究鼠受精素β胞外区(Fβextracellular domain,F_(β.ECD))真核表达重组质粒pSG.SS.C3d3.YL.F_(β.ECD)的DNA疫苗免疫避孕效应。方法应用pSG.SS.C3d3.YL.F_(β.ECD)(C3d3-YL-Fβ组)肌注雌鼠,观察其免疫避孕效应,ELISA法检测雌鼠血清抗Fβ蛋白IgG抗体最大稀释度、IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平和阴道分泌物抗Fβ蛋白IgA抗体最大稀释度。对照组为PBS组、空载体pSG.SS.YL组(空载体组)和pSG.SS.YL.Fβ.ECD(YL-Fβ组)。结果C3d3-YL-Fβ组雌鼠生育能力显著降低,雌鼠妊娠率显著降低,一胎产仔数量显著降低,免疫避孕效果显著好于YL-Fβ组。pSG.SS.C3d3.YL.F_(β.ECD)DNA疫苗可激发雌鼠产生高水平血清抗Fβ蛋白IgG抗体,阴道分泌物中出现抗Fβ蛋白IgA抗体,血清IL-2、INF-γ浓度较对照组显著降低,血清IL-4、IL-10浓度显著增加。结论真核表达重组质粒pSG.SS.C3d3.YL.Fβ.ECD可有效诱导雌鼠免疫性避孕效应,效果优于pSG.SS.YL.F_(β.ECD)。

表达鼠精子受精素β的减毒沙门菌疫苗株的构建

目的 构建表达鼠精子抗原受精素 β亚单位 (Fβ)的可口服减毒沙门菌活疫苗株。 方法 通过酶切从克隆载体TOPO中获得FβcDNA片段 ,将其插入表达载体PYA314 9中 ,构建重组质粒pFFL ,将该重组质粒转入鼠沙门伤寒杆菌疫苗株X4 6 32 ,获得重组菌株X4 6 32 (pFFL) ,行Westernblot分析及初步毒性试验。 结果 此无抗药性的重组菌株X4 6 32 (pFFL)可稳定表达被Fβ 抗体识别的重组Fβ 蛋白 ,口服该菌株无明显毒性作用。 结论 该疫苗株的构建为研究以Fβ 为靶抗原的精子抗原避孕疫苗打下了基础 ,值得进一步行诱导免疫观察。