胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞(male germ stem cells , mGSCs)来源于原始生殖细胞(primordial germ cells ,PGCs) ,且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs ,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到95.8 %。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示:SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament ,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明:20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干(embryonic stem,ES)细胞。

胎鼠牙胚细胞体外培养研究

目的 摸索正常胎鼠牙胚细胞离体培养所需条件 ,为进一步将其作为牙组织工程种子细胞奠定基础。方法 体视显微镜下取 17d龄胎鼠下颌第一磨牙牙胚 ,胶原酶 /分离酶消化 ,以含 10 %胎牛血清 (FCS)的DMEM为培养基进行原代培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长特点 ,MTT法测定细胞活性绘制生长曲线 ,取原代培养 4～ 9d的细胞进行组织化学和免疫组织化学染色。结果 倒置显微镜下观察 ,培养细胞在 2 4h内贴壁 ,约 7～ 9d生长连成片状 ,细胞有多角形、大而扁平梭形和长梭形几种形态。生长曲线表明 :培养细胞在前 3天生长缓慢 ,第 4天呈对数生长 ,第 7天达高峰。免疫组化结果表明 :培养细胞来源于两种组织。结论 采用酶消化培养法 ,用胶原做基质饲养层 ,含 10 %FCS的低糖DMEM作为培养基 ,能将胎鼠牙胚细胞培养成活 ,并维持其细胞学特征。

遗传背景和胎儿日龄对猪类胚胎生殖细胞培养的影响

本试验研究了遗传背景和胎儿日龄对猪类胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EG)培养的影响,分别利用五指山猪(WZSP)和微型白猪胎儿为试验材料,比较了2种猪胎儿在EG培养方面的异同。试验结果表明,在相同条件下,2种猪均得到了可以传代的EG细胞集落,得到的EG集落AP染色呈阳性,体外培养能形成类胚体,类胚体继续培养能分化成多种细胞。试验比较了5个指标:平均第1次出现EG集落时间(T1)、第1次出现大批EG集落时间(T2)、第1次传代时间(T3)、平均传代间隔(T4)及传代情况(P),结果显示,WZSP和微型白猪2个品系差异不显著(P>0.05),表明WZSP和微型白猪都可以用来作为猪EG细胞建系的材料;分别采集第26、27、28天胎儿比较日龄对EG培养的影响。试验测量了不同日龄胎儿中肾大小,比较以上5个指标,观察胎儿日龄对建立猪EG细胞系方面的影响,结果表明第26、27、28天胎儿在EG培养方面差异不显著(P>0.05)。

大鼠胚胎睾丸组织体外培养方法的建立

目的:建立大鼠胚胎睾丸组织体外培养方法。方法:取SPF级性成熟(体重200～250 g) SD雄性大鼠3只、雌性6只,根据阴道涂片判断雌鼠所属的发情时期,在其发情期及发情前期按照1∶2合笼,发现精子则记为怀孕0. 5 d(0. 5 dpc)。解剖显微镜下分离出15. 5 dpc胚胎睾丸,一式2份,1份直接进行HE染色,另1份置于软琼脂糖培养系统,37℃、5%CO_2进行培养,分为对照组和hC G组。培养当天为d0,倒置显微镜记录培养睾丸生长情况,每天更换并收集d1、d2、d3、d4培养液及d4的睾丸组织。检测培养液睾酮浓度,培养结束后睾丸固定脱水包埋进行组织学研究。结果:应用阴道涂片方法可高效获得15. 5 dpc大鼠,HE染色提示能准确分离出15. 5 dpc胚胎睾丸。倒置显微镜下可见培养睾丸发育良好,体积逐渐增大,生精小管逐渐增粗、迂曲、清晰。培养液中可检测到睾酮,且睾酮浓度逐渐增高,d3时达到峰值; hC G可刺激睾酮分泌。HE染色可见培养后睾丸组织结构完整,无中央坏死现象发生,组织内有典型的生精小管,可见生殖母细胞、支持细胞及间质细胞;透射电镜下可见生精小管管腔中的生殖母细胞、支持细胞以及管腔外的间质细胞,细胞内的线粒体、内质网等细胞器,未见明显肿胀。结论:大鼠胚胎睾丸组织可在软琼脂糖培养系统中生长良好、保持活性,并向培养液中分泌睾酮。

Recent advances in mammalian reproductive biology

Reproductive biology is a uniquely important topic since it is about germ cells, which are central for transmitting genetic information from generation to generation. In this review, we discuss recent advances in mammalian germ cell development,including preimplantation development, fetal germ cell development and postnatal development of oocytes and sperm. We also discuss the etiologies of female and male infertility and describe the emerging technologies for studying reproductive biology such as gene editing and single-cell technologies.