促红细胞生成素基因修饰的胎肝基质细胞促进脐血CD34+细胞向红系分化

通过重组慢病毒系统感染人胎肝基质细胞(fetal liver stromal cells,FLSCs),建立了能够稳定高效表达促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的细胞株EPO/FLSCs.从胎儿肝脏克隆EPO基因,构建重组慢病毒EPO的表达载体,感染FLSCs,根据荧光表达强弱进行流式分选,获得能够继续稳定传代的高表达EPO基因的FLSCs,RT-PCR和ELISA结果证实,细胞株中的EPO基因稳定表达.RT-PCR结果显示,FLSCs的EPO在mRNA水平的表达分别是未转染FLSCs和转染空载体FLSCs的5.63倍和5.71倍.ELISA法检测了转染重组慢病毒EPO表达载体的FLSCs EPO蛋白表达水平,结果显示EPO蛋白的表达水平也明显升高.收集EPO/FLSCs的条件培养基,体外诱导脐血CD34+细胞向造血细胞分化,结果显示向红系定向分化的细胞比例明显居多,有可能为临床细胞治疗提供稳定、高质量的细胞来源.

体外诱导人骨髓间充质干细胞向造血细胞分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞(hMSC)向造血细胞分化的可行性及分化条件。方法首先建立hMSC的分离培养扩增体系,制备小鼠胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM),将hMSC接种在分别含FLSC-CM和IL-6、SCF组合的培养体系中,通过形态学、直接免疫荧光染色检测法、粒-单/巨噬系集落形成细胞培养(CFU-GM)对分化细胞进行鉴定。结果hMSC经FLSC-CM诱导培养9天后,产生较多的悬浮细胞,悬浮细胞瑞士染色后形态类似于单核或小淋巴细胞,表达人CD34和人CD45表面抗原。且能够形成造血祖细胞集落(CFU-GM)。结论FLSC-CM可诱导hMSC分化为具有造血干/祖细胞特性的前体细胞。

慢病毒介导的稳定表达bFGF的胎儿肝脏基质细胞株的建立

通过重组慢病毒系统感染人胎儿肝脏基质细胞(fetalliverstromalcell,FLSC),建立了能够稳定、高效表达碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的细胞株bFGF/FLSC.从流产胎儿肝脏组织分离富集基质细胞,对其进行了生长特性和表面标志的鉴定,其在体外维持传代35代,依然保持正常的染色体核型.从胎儿骨髓间充质干细胞中克隆得到bFGF基因,构建重组慢病毒载体,感染FLSC,根据荧光表达强弱进行流式分选,获得能够继续稳定传代的低表达和高表达bFGF的两株细胞,RT-PCR和蛋白质印迹证实,细胞株中bFGF基因的稳定表达.RT-PCR结果显示,弱荧光和强荧光表达细胞的bFGF,在mRNA水平的表达分别是转染空载体细胞的2.33倍和6.19倍;蛋白质印迹结果显示,在蛋白质水平表达分别是1.76倍和5.05倍.用建立的bFGF/FLSC作饲养层细胞体外培养人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells,hES),结果证明,其能在无或少量添加外源bFGF的条件下,维持人ES细胞增殖及其干性达20代.bFGF/FLSC细胞株的建立,将为构建低成本、安全高效的人胚胎干细胞的培养体系及研究造血细胞的发育分化提供适宜的微环境.

人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析

为了筛选在主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞中差异表达的基因,以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为“实验方”,以源自意外而致流产的孕4-5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为“驱动方”,建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库。进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选,并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析。结果表明在所构建的AGM抑制消减杂交文库中,经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200-700bp的克隆有211个,阳性率高达76.4%。经过基因芯片筛选,挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示,在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中,4个为未知基因,14个为已知基因,其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程。这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道。结论筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了必要的理论基础。

不同造血微环境对诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响

目的:通过观察人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化诱导效率,探讨不同造血微环境对造血发生的影响。方法:本实验诱导人胚胎干细胞分化为造血细胞的方法采用两步法:先用细胞因子培养形成5d的拟胚体,然后再模拟体内造血发生的微环境,分别用人卵黄囊基质细胞、人胎肝基质细胞和人胎骨髓基质细胞诱导拟胚体10d,通过流式细胞术检测细胞的flk,CD34和CD45表面抗原表达情况,观察3种基质细胞对人胚胎干细胞向造血细胞分化的影响。结果:5d拟胚体与卵黄囊基质细胞接触培养10d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别1.80%±0.56%,1.30%±0.14%,1.05%±0.63%;与胎肝基质细胞接触培养10d生成的细胞表达为flk,CD34,CD45百分率分别为34.0%±25.45%,38.4%±24.8%,72.6%±25.7%;与骨髓基质细胞接触培养10d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别为2.50%±1.48%,3.20%±0.56%,1.65%±0.21%;5d拟胚体自发分化10d生成的细胞表达flk,CD34,CD45百分率分别为0.30%±0.07%,0.65%±0.07%,0.15%±0.07%。与自发分化10d比较,3种基质细胞与5d拟胚体接触培养,均能够促进拟胚体向造血细胞的分化,且胎肝基质细胞诱导的效率显著优于其他两种基质细胞(P(0.05)。结论:与卵黄囊基质细胞和骨髓基质细胞比较,胎肝基质细胞更有利于诱导人胚胎干细胞向造血细胞的分化。

小鼠胎肝造血基质细胞系对CFU-GM生长的调控作用

利用本实验室建立的小鼠胎肝造血基质细胞系(MFLSC)研究了造血基质细胞对粒-巨噬系造血祖细胞(CFU-GM)生长的影响。实验结果表明,MFLSC对CFUGM集落的生成有双向调控作用,即既有刺激性作用,又有抑制性影响。这种调控有体液因子之中介,亦有细胞与细胞间近距离的效应。文中讨论了MFLSC双向调控CFUGM生长的意义及其机理。

一种新的人胚胎干细胞无饲养层培养方法的建立

目的:以转染碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的人胎肝基质细胞株(FLSC)培养人胚胎干细胞(hESC),寻找更加安全、有效的体外培养扩增方法。方法:通过ELISA方法定量检测转基因的人FLSC条件培养基中bFGF的分泌量;以商业化的mTeSR1无血清无饲养层培养基、常规小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基,以及转染bFGF的人FLSC条件培养基(bFGF/FLSC-CM)分别培养扩增H9细胞。通过观察hESC形态、免疫荧光染色、流式细胞检测及RT-PCR,检测hESC全能性标志物的表达。结果:ELISA方法检测bFGF/FLSC-CM中bFGF因子的分泌量为(770.09±17.28)pg/mL,而MEF-CM中bFGF因子的分泌量为(55.59±0.61)pg/mL,两者存在显著差异(P<0.01);在3种培养体系下,免疫荧光检测hESC全能性标志Oct-4、Tra-1-81抗体的表达均呈阳性,流式检测细胞表面阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)抗体阳性细胞的比例均在99%左右;RT-PCR检测到hESC特异的转录因子Oct-4、Nanog、Sox-2的表达。结论:以转染bFGF的人FLSC条件培养基可以有效扩增hESC,可为临床应用提供一种安全、高效、低成本的无饲养层培养方法。

胎肝-骨髓程序移植提高移植效果

为进一步提高骨髓移植效果。以昆明种小鼠急性放射病为模型，进行了胎肝－骨髓程序移植（ＦＬ－ＢＭＳＴ）后小鼠活存及造血重建、急性移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）的研究。胎肝－骨髓程序移植 １ｘ １０６个骨髓细胞时，于照射后第 １７ｄ外周血白细胞、骨髓有核细胞计数接近正常，ＣＦＵ－Ｅ、 ＣＦＵ－ＧＭ、 ＣＦＵ－Ｆ、 ＣＦＵ－Ｓ已达正常； ＧＶＨＤ较一次骨髓移植组轻；活存率达６０％，显著高于一次骨髓移植组。胎肝-骨髓程序移植既充分利用了每次腾出的“龛位”（Ｎｉｃｈｅ），又通过移植胎肝基质细胞改善了“龛位”，增加了“龛位”，从而增加了干、祖细胞的植入并加快增殖分化，减少了移植细胞数，提高了移植效果；是一种较好的移植新方法。

人胎肝基质细胞培养上清液中造血生长因子的分析

采用人胎肝造血基质细胞的体外液体培养技术,结合造血干细胞和祖细胞的体外测试方法,研究了造血基质细胞所释放的造血生长因子与造血干细胞和祖细胞之间的相互作用。结果表明,在适宜的条件下,人胎肝造血基质细胞可在体外传代培养达100d之久。培养过程中,对不同时间收集的培养上清液进行测试的结果表明,这些贴壁细胞可以不断地释放多种造血活性物质。在100d培养过程中,上清液中始终都可以检出CFU-S增殖刺激物活性。培养第24天的上清液中还可检出BPF和GM-CSF活性。这些造血活性物质对CFU-S的生理状态和祖细胞的增殖与分化有着深刻的影响。但是在培养上清液中未检出IL-3样活性物质。

人脐带血单个核细胞联合人脐带间充质干细胞疗法对乙型肝炎肝硬化患者肝功能、炎症程度及免疫功能的影响

目的探讨人脐带血单个核细胞(hUCB-MNCs)联合人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对乙型肝炎相关失代偿期肝硬化患者的肝功能、炎症程度及免疫功能的影响。方法选取2016年11月-2019年6月在内蒙古医科大学附属医院诊治的11例肝硬化患者,所纳入患者第1周输注1次hUCB-MNCs(>18×10^(9)/次),第2、3、4周每周输注1次hUC-MSCs,每次输注1×10^(6)/kg,在治疗结束的第4、8、12周进行复查,对比治疗前后肝功能、血氨、凝血因子、血清细胞因子及淋巴细胞亚群的变化,同时观察记录神经、精神症状的改变。计量资料组间比较采用单因素重复测量方差分析。结果hUCB-MNCs联合hUC-MSCs治疗后的11例患者其精神、神经症状与细胞输注前相比较有所改善;肝功能各项指标及凝血功能基本趋于正常(P值均<0.05);细胞联合输注后的第12周,血氨水平显著下降(P<0.05);炎性细胞因子IL-6、TNFα水平降低(F值分别为49.497、37.071,P值均<0.05);而抗炎细胞因子TGFβ和IL-10水平显著上升(F值分别为35.843、15.918,P值均<0.05);同时CD3^(+)CD8^(+)T淋巴细胞和CD19^(+)B淋巴细胞均降低(F值分别为52.242、89.097,P值均<0.05);免疫调节性T淋巴细胞CD4^(+)CD25^(+)Treg明显升高(F=17.337,P<0.05)。结论hUCB-MNCs联合hUC-MSCs治疗肝硬化,与细胞输注前相比较,可改善肝功能,减少炎性细胞因子产生,减轻肝脏炎症反应以及肝细胞的破坏,升高免疫调节性T淋巴细胞,从而影响其自身免疫功能。

小鼠胚肝基质细胞在体外培养中的动态演化

胚肝基质细胞是研究胚肝造血调控的重要工具 ,本实验对小鼠胚肝基质细胞在体外培养过程中的生长、细胞类型组成及其组成比例的演变过程进行了观察 .实验显示小鼠原代培养初期基质细胞是由平滑肌样上皮细胞、巨噬细胞以及成纤维样细胞、树突状细胞、内皮细胞构成的 ,经过多次传代后 ,巨噬细胞等类型的细胞逐渐丢失 ,平滑肌样上皮细胞和成纤维样细胞成为主体 ,表明体外培养的小鼠胚肝基质细胞在 4代以内都能较真实的反映体内造血微环境的构成 ,适用于胚肝造血研究 .此为进一步研究胚肝基质细胞在胚胎期造血过程中的作用奠定了工作基础 .

小鼠胎肝基质细胞高活性造血刺激因子的纯化及性能研究

对我室克隆的小鼠胎肝基质细胞林(MFLSC株)的无血清培养上清中的造血活性物质进行了初步纯化。通过离子交换层析和凝胶过滤层析两步分离,从中得到一高活性的造血刺激因子,称为基质细胞造血刺激因子-1(SHF-1)。经凝胶过滤及电泳结果估测,此因子是分子量约为70kD的单体蛋白,耐碱,较耐热。在体外它对小鼠骨髓粒系、红系祖细胞、多向祖细胞及多能造血干细胞均有刺激作用。

小鼠胎肝基质细胞造血刺激因子体外生物活性研究

本实验对基质细胞造血刺激因子－１（ＳＨＦ－１）的体外生物活性进行了研究。结果表明，ＳＨＦ－１可刺激小鼠骨髓ＣＦＵ－Ｅ、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｍｉｘ集落的形成，它产生的这些广泛造血刺激作用是其自身所具活性的直接影响。正常小鼠骨髓细胞与ＳＨＦ－１在体外孵育４ｈ，其中ＣＦＵ－Ｓ的自杀率可提高约１０％，显示它对造血干细胞也有诱导增殖作用。

2类小鼠胎肝基质细胞的生物学特征及表达谱分析

目的·探究不同类型小鼠胎肝基质细胞在细胞形态、分子特征和生物学功能上的差异。方法·通过体外贴壁培养的方式获取13.5 d小鼠胎肝基质细胞,根据细胞形态及其表面标志物CD44、CD29、CD106、CD45及Sca-1的表达差异,区分不同的细胞类型。使用小鼠基因组阵列4302.0基因芯片在P<0.05、差异倍数>3或<-2的标准下筛选差异基因,并使用IPA(ingenuity pathway analysis)软件对典型信号通路和生物学功能进行分析。结果·依据细胞形态的不同,分离出2类胎肝基质细胞,即短梭形细胞(CD45^+CD106^-CD29^+CD44^+Sca-1-)和成纤维样细胞(CD45^-CD106^+CD29^+CD44^+Sca-1^-)。前者共筛选出1485个高表达基因,主要参与免疫炎症相关的信号通路;后者共筛选出3374个高表达基因,主要参与细胞外基质形成及细胞间黏附。结论·小鼠胎肝基质细胞在生物学特征及功能上具有较强的异质性,在促进造血干细胞的增殖方面可能存在差异。

非转化集落来源的胎肝基质细胞系的建立及鉴定

为研究胎肝基质细胞在调控造血方面的作用,需要对基质细胞进行分离和扩增。利用早期胎肝细胞原代培养上清液具有刺激基质细胞增殖的活性,得到了4个集落来源的胎肝基质细胞系,其中最长的体外培养时间达3个多月。基质细胞经液氮冻存复苏后能保持生长增殖能力。基质细胞系的细胞化学染色显示碱性磷酸酶阴性(AkP)、酸性磷酸酶阳性(AcP^+)和非特异性酯酶阳性(NSE^+)。基质细胞有吞噬鸡红细胞的功能。免疫细胞化学染色的结果为:波形蛋白阳性(vimentin^+)、巨噬细胞抗体-1阳性(macrophage Ab-1^+),巨噬细胞抗体-2 阳性(macrophage Ab-2^+),CD15^-,CD45RA^-,CD71^-,纤连蛋白阳性(fibronectin^+)和胶原IV型阴性(collagen IV^-)。研究表明此基质细胞系的成分为巨噬细胞。建立非转化的、集落来源的胎肝基质细胞系的方法是可重复的。所获得的基质细胞系为研究胎肝造血微环境中基质细胞的作用提供了基础。

小鼠胎肝基质细胞系MFLC自发分泌多种细胞因子

在无外源刺激条件下,我室所建小鼠胎肝基质细胞系MFLC可自发分泌多种类型细胞因子,其中IL-6及化学趋化因子水平较高,GM-CSF水平较低,但未检测到IL-3及IL-7活性。此细胞上清对小鼠骨髓造血干细胞有明显的促集落形成效应,并呈现剂量依赖关系,所形成的集落以CFU-GMM及CFU-GM为主;此细胞上清还促进5-Fu耐受小鼠骨髓造血干细胞的集落形成,提示上清中存在SCF样活性成份。上述结果表明,MFLC的建立有利于分析干细胞在胎肝内如何向pro-T细胞分化发育的机理并有利于阐明细胞因子网络调节在其中的作用。

小鼠胎肝基质细胞系MFLC的建立及鉴定

用体外长期培养的方法建立了小鼠胎肝基质细胞系（ｍｕｒｉｎｅｆｅｔａｌｌｉｖｅｒｃｅｌ，ＭＦＬＣ），并运用免疫荧光技术、电镜技术、倍增时间的测定及染色体检查等方法，对此细胞系进行了细胞学鉴定。此细胞系建立至今已２年，历经３个阶段。细胞为多角形，用免疫荧光法显示胞浆内含角蛋白，同时也表达Ｓ－１００和波形蛋白。电镜观察可见细胞形态多样，有些细胞含成束的张力丝，有些相邻细胞间有桥粒结构，部分细胞内可见病毒颗粒。细胞Ｉａ表达呈强阳性，细胞倍增时间为２４ｈ。染色体为异倍体（５０～７８条），结果表明，本实验所建成的ＭＦＬＣ是以上皮细胞为主的已转化的胎肝混合细胞系。

胎肝基质细胞强化骨髓移植治疗急性放射病

目的为进一步提高骨髓移植效果。方法以昆明种小鼠急性放射病为模型，进行了胎肝基质细胞强化同种异基因骨髓移植，观察了小鼠造血重建、急性移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）及小鼠存活率。结果胎肝基质细胞移植可强化骨髓移植效果，与单纯骨髓移植组比较，于照射后第１１天小鼠外周血白细胞、骨髓有核细胞计数，ＣＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｆ、ＣＦＵ－Ｓ回升较快，ＣＦＵ－Ｆ已达正常，于照射后第１７天造血得以重建；ＧＶＨＤ较轻，存活率显著提高，达６０％。结论胎肝基质细胞改善了造血微环境，可能既改善了“龛位”，又增加了“龛位”使干细胞更多的植入，促进了造血重建，提高了骨髓移植效果，是一种“种子与土壤”并重的移植新方法。

以人胎肝基质细胞为饲养层有效扩增脐带血CD34^+细胞

目的以人胎肝基质细胞(fetal liver stromal cell,FLSC)作为饲养层,进行脐带血CD34+细胞的扩增培养,寻找更加有效的体外扩增方法。方法比较脐带血CD34+细胞在无饲养层和人FLSC饲养层条件下,培养7,13,15d的细胞增殖状况;并利用流式细胞仪检测不同时间点CD34+细胞的比例。结果随着培养时间的延长,脐带血CD34+细胞的扩增呈现时间依赖性改变;在FLSC饲养层条件下,CD34+细胞培养7,13,15d的扩增数量分别为(11.83±0.76)×105,(14.37±0.32)×105和(18.73±0.25)×105,而在无饲养层条件下的扩增数量分别为(2.90±0.10)×105,(8.87±0.15)×105和(11.97±0.15)×105,两者相比有显著性差异(P(0.01);此外,流式细胞仪检测各时间点CD34+细胞的比例,在培养第13天,FLSC饲养层条件下CD34+细胞的比例为10.21%,而在无饲养层为1.01%,两者存在显著差异。结论以人FLSC作为饲养层可以有效扩增脐带血造血干/祖细胞,为今后临床造血干细胞移植提供充足的细胞来源。

小鼠胎肝造血基质细胞株无血清培养上清中造血负调控物质的初步研究

采用离子交换层析和凝胶过滤层析方法，从小鼠胎肝造血基质细胞株（ＭＦＬＳＣ株）无血清培养上清中纯化出一个对红系及粒系造血祖细胞生长表现抑制作用的组分。此抑制活性组分的分子量约为６０－７０ｋＤａ，高热和蛋白酶处理可使之灭活。文中讨论了该组分的可能本质及与胎肝造血调控的关系．