豆渣复配粉对老龄大鼠蛋白质消化动力的影响

我国老龄化人口逐年递增,老年人消化机能减退,进而影响健康状况.以老龄大鼠为动物模型来研究富含膳食纤维的豆渣复配粉对其肠道消化蛋白质功能的影响,进而对豆渣膳食纤维在老龄人中的应用提供理论依据和实践参考.采用挤压膨化的方法制备了大豆渣复配粉,复配粉中豆渣与淀粉的比例为3∶7,复配粉可溶性膳食纤维的含量平均值为15.47%.大鼠试验选用15月龄大鼠15只,随机分为3组,分别接受3个处理:标准日粮组(AIN)、鱼肉蛋白组(FP)、鱼肉蛋白+豆渣复配粉组(FPS,0.3g/kg).每组5只大鼠,大鼠单笼饲养,组内设5个重复.结果表明:FPS组大鼠蛋白质整肠道消化率较其他2组显著提高(P<0.05),FP组显著降低了蛋白质消化率(P<0.05),FP组和FPS组大鼠肠道胰蛋白酶和肠肽酶都显著高于对照组(P<0.05),FPS组大鼠肝脏氨肽酶(APN),小肽转移酶(PepT1)和谷氨酸脱氢酶(GDH)mRNA表达量分别显著高于其他2组(P<0.05).以上研究结果说明豆渣复配粉有利于提高老龄大鼠对日粮蛋白的消化率,改善肠道相关蛋白消化酶的基因表达.

血清4型禽腺病毒Fiber-2蛋白截短表达及单克隆抗体制备

【目的】获得截短表达的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-2重组蛋白及其单克隆抗体,为建立快速灵敏的病毒检测方法提供基础材料。【方法】对Fiber-2基因序列进行密码子优化,截取Fiber-2蛋白抗原性集中片段,PCR扩增其基因序列,连接至pET-32a(+)构建原核表达载体。将表达的重组蛋白进行纯化,并通过Western blotting验证其在大肠杆菌中的表达情况。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠后取脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法筛选阳性细胞株,再利用秋水仙素裂解法、间接ELISA法和间接免疫荧光法(IFA)对其进行鉴定。【结果】成功构建Fiber-2基因截短片段的原核表达系统,获得大小约为67 kD的Fiber-2截短蛋白,以包涵体的形式出现,经纯化后可获得单一的特异性条带,经Western blotting鉴定证明其可与FAdV-4阳性血清结合从而产生一条特异性条带。经过4次亚克隆后筛选到5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(2C2、4F6、5A5、6G10和10B5),其抗体分泌稳定性、特异性好,诱生的细胞上清液抗体效价为1:1600~1:6400,腹水抗体效价为1:320000~1:1280000,秋水仙素裂解检测染色体数目为94~110条。2C2、4F6和10B5杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG2b亚型,轻链为Kappa链;5A5和6G10杂交瘤细胞分泌的抗体重链为IgG1亚型,轻链为Kappa链。5株杂交瘤细胞株与感染FAdV-4的鸡肝癌上皮细胞系(LMH)进行IFA检测,结果均为阳性。【结论】制备的Fiber-2截短重组蛋白及单克隆抗体具有良好的反应原性和特异性,可用于FAdV-4病毒检测试剂盒研发。

帕金森病患者皮肤小神经纤维病理研究

目的探讨帕金森病(PD)患者皮肤小神经纤维的病理特点。方法收集16例临床确诊并符合纳入和排除标准的PD患者和性别年龄匹配的16例健康对照者的临床资料和神经电生理结果,对PD症状及周围神经病变进行评估。所有受试者行小腿皮肤活组织检查,通过标准化泛轴突标记蛋白基因产物9.5(PGP9.5)和生长相关蛋白43(GAP-43)两种免疫组织化学染色定量表皮内神经纤维密度(Intraepidermal nerve fiber density,IENFD),并进行统计学分析。结果16例PD患者,男7例,女9例,年龄(66.000±9.675)岁,Hoehn and Yahr(H-Y)分期(1.906±0.612)。PD组尺神经、正中神经、腓肠神经远端感觉潜伏期较对照组延长(P<0.05),余2组间神经电生理结果未见统计学差异(P>0.05)。PD组PGP9.5和GAP-43染色下IENFD值均低于健康对照组(8.618±3.984根/mm vs18.198±5.387根/mm,4.543±3.363根/mm vs 14.174±5.485根/mm;P<0.05)。两种染色下IENFD值与PD的临床症状有相关性。GAP-43/PGP9.5染色下IENFD比值在2组之间无统计学差异(0.575±0.380 vs 0.787±0.218;P>0.05)。结论PD患者存在周围神经损害,以小神经纤维受累为主,大直径神经纤维受累不明显,皮肤活检是诊断PD小纤维神经病较为可靠的方法。

羊毛KAPs家族基因及转录因子AP-1调控作用预测的研究进展

羊毛是养殖业重要的畜产品,具有较高的经济价值。角蛋白关联蛋白(KAPs)是羊毛纤维主要的蛋白质成分,包含诸多亚家族,构成了羊毛的主体,同时也决定了羊毛的各类经济性状。羊毛生长发育过程中角蛋白关联蛋白基因(KRTAPs)受到各种转录因子调控,KRTAPs表达具有高度的组织特异性和时空性,转录因子是KRTAPs表达的核心调控因素。本文主要从KAPs分类及其家族基因与羊毛性状的关系、转录因子AP-1的分类和功能以及KRTAPs启动子区域AP-1结合位点的预测等方面进行概述,以期为探究羊毛组分及其基因相关功能和羊毛性状的分子育种提供理论参考。

子宫腺肌病PGP9.5、NGF的表达及其与痛经的关系

目的研究蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP 9.5)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)在子宫腺肌病(adenomyosis,ADS)在位内膜功能层和腺肌病灶中的表达及其与痛经的关系,探讨神经纤维及其生长因子在子宫腺肌病痛经中的作用。方法采用免疫组化SP法,检测ADS在位内膜功能层和病灶组织,对照组在位内膜功能层、肌层组织中PGP 9.5、NGF的表达;通过视觉模拟评分法(visual analogue scale/score,VAS)对ADS痛经程度评分,并分析其与上述因子的相关性。结果 PGP 9.5在ADS在位子宫内膜功能层中呈特异性表达;与对照组相比,PGP 9.5、NGF的表达在ADS在位内膜功能层和病灶中明显增高(P<0.05);ADS在位内膜功能层和ADS腺肌病灶中PGP 9.5、NGF的表达与痛经程度有显著相关性,差异有统计学意义(P<0.05),r分别为0.520和0.688,0.543和0.503。结论 ADS在位内膜功能层中PGP 9.5的特异性表达,可能为ADS诊断提供新的途径;ADS中PGP 9.5、NGF的高表达与其痛经程度呈正相关。

不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析

根据已发表的ＣＡＶ纤突基因序列，用ＰＣＲ方法，对４个ＣＡＶ－２毒 株和４个ＣＡＶ－１毒株的纤突基因进行了扩增和测序，测定的核苷酸序列经推导得到分别编 码５４３和５４２个氨基酸的ＣＡＶ纤突蛋白全序列。测定的ＣＡＶ－２比较表明：我国流行的ＣＡＶ－２ ＳＹ 强毒株与国外标准强毒株Ｔｏｒｏｎｔｏ Ａ２６／６１株相同，其驯化致弱的毒株与驯化前相比在１１３４位 发生碱基颠换。测定的ＣＡＶ－１比较表明：我国流行的ＣＡＶ－１株与标准强毒ＲＩ２６１株差异相对 较大，而国内ＣＡＶ－１毒株互相之间相对差别较小。ＣＡＶ－２与ＣＡＶ－１纤突基因的同源性为８０．４８％。

棉花细胞壁蛋白基因分离鉴定与表达分析

棉纤维起源于棉花胚珠外层表皮细胞.研究棉纤维发育,具有重要理论和实践意义.从棉纤维等组织cDNA文库中分离了186个棉花细胞壁结构蛋白基因,按照所编码的蛋白质结构特点,可将这些基因分为三类:富含脯氨酸细胞壁蛋白(P ro line-rich ce llw a ll prote ins,PRP s)基因、伸展蛋白(Ex tens ins)或者富含羟脯氨酸糖蛋白(Hydroxypro line-rich g lycoprote in,HRGP)基因,富含甘氨酸蛋白(G lyc ine-rich prote ins,GRP s)基因.采用cDNA m icroarray技术,比较上述基因在开花后10天的野生型棉花纤维和无絮无绒(fuzzless-lin tless,fl)突变体胚珠表皮中表达谱发现,其中有7个基因在野生型纤维中特异性或高效性表达,表明它们可能与纤维发育有关.

犬2型腺病毒毒株纤突蛋白基因的比较分析

根据 Gen Bank中犬腺病毒 (canine adenovirus,CAV)纤突基因序列 ,设计合成 2对引物。用 PCR方法 ,对犬 2型腺病毒沈阳分离株 (CAV- 2 SY株 )第 5代强毒 (SY- V5 )、经蚀斑克隆驯化的第 6 0代毒弱毒 (SY- V6 0 )、SY- V6 0在易感犬体上传 5代的回收毒 (SY- CP5 )、美国疫苗毒 (U S- V2 0 )等 4个毒株的纤突基因进行了扩增 ,PCR产物经纯化后进行基因序列测定 ,测序结果经拼接后得到了 1个由 16 2 9个核苷酸组成的纤突蛋白全基因序列 ,编码 5 43个氨基酸。犬2型腺病毒与 Gen Bank中的标准的 CAV- 2强毒株 (Toronto A2 6 / 6 1)纤突蛋白基因序列的比较结果表明 :CAV- 2 SY株强毒株与 Toronto A2 6 / 6 1株相同 ;SY- V6 0株与 SY- CP5相同 ;与驯化前的 SY- V5相比 ,在 1134位发生碱基颠换 ,编码的氨基酸由原来的天冬酰氨 (N)变为赖氨酸 (K) ,并导致 N- X- S/ T潜在糖基化位点发生改变 ,US- V2 0该部位也发生同样的突变 ,本试验测定和比较的 CAV- 2强毒株有 5个潜在的 N-联糖基化位点 ,弱毒株仅有 4个位点 ;U S- V2 0与 Toronto A2 6 / 6 1差异较大 ,有 11个碱基发生变化 ,导致 8个氨基酸的变异。

一类新的编码PRPs基因的分离及其在棉花纤维等组织细胞中的表达

富含脯氨酸的细胞壁蛋白(proline-rich proteins,PRPs)在植物中广泛分布,它们在建造围绕特定细胞类型的细胞壁结构上起着很重要的作用.从棉花的cDNA文库中分离了5个编码富含脯氨酸的细胞壁蛋白质基因,这5个基因推断的氨基酸序列最普遍的特点就是脯氨酸含量非常高.根据氨基酸组成、富含脯氨酸的重复单元和结构域组织的特点,将这5个蛋白质分成2个亚类:一类(包括GhPRP3-6)与典型的PRPs结构相似,由N端疏水区(或信号肽)与不同富含脯氨酸的重复序列组成;另一类(GhPRPL)与典型的PRPs结构不同,这个蛋白质的N端为亲水序列,GhPRPL在靠近C端有8个5肽(类似PPKKE)的重复基序,与典型PRPs所含有的重复序列PPVYK非常相似.实时RT-PCR(Real-time RT-PCR)分析表明,GhPRP3和GhPRP5在10dpa纤维中特异表达,而GhPRPL在子叶中优势表达.GhPRP4和GhPRP6在所分析的组织中都有表达,GhPRP4mRNA在下胚轴中最丰富,在花药中次之,而GhPRP6在10dpa纤维中表达最强,在10dpa胚珠中次之.此外,GhPRP3,GhPRP5基因表达受纤维发育调节,表明它们可能在棉纤维发育中起重要作用.

两个棉花Rac蛋白基因的克隆与表达分析

为研究棉花纤维起始和伸长的分子机理 ,在棉花纤维EST序列分析的基础上 ,从棉花纤维中扩增并克隆了 2个棉花Rac蛋白的cDNA基因 ,分别命名为GhRacA和GhRacB。GhRacAcDNA长 95 9bp ,推测的编码蛋白包含2 11个氨基酸。GhRacBcDNA长 92 0bp ,编码 195个氨基酸的蛋白。GhRacA和GhRacB蛋白均含有GTP/GDP结合和激活区域、Effector区和碱性氨基酸区。GhRacB的C末端有保守的异戊烯基化位点CSIL ,而GhRacA没有明显的异戊烯基化位点。序列比较分析表明 ,GhRacA和GhRacB是 2个新的棉花Rac蛋白。RT PCR分析表明 ,GhRacA和GhRacB在根、下胚轴、茎、叶和纤维中都有表达 ,但均在棉花纤维起始和伸长时期有优势表达 ,推测

三个编码富含甘氨酸异构体的基因在棉花不同组织的差异表达

从棉花cDNA文库中分离了3个编码富含甘氨酸蛋白(glycine-rich proteins,GRPs)的基因,分别命名为GhGRP1、GhGRP2、GhGRP3.推断的编码蛋白质的氨基酸序列都富含甘氨酸,甘氨酸含量超过40%.而且GhGRP1和GhGRP2蛋白质序列同源性高达99%,仅在C末端有1个氨基酸残基(Arg/Pro)的差别.这3个蛋白在富含甘氨酸区相互显示较高的同源性,GhGRP1与GhGRP2达到100%,而GhGRP2与GhGRP3达到45·1%,但它们与基因数据库中其它蛋白质的同源性很低.根据结构域的组织特点,将GhGRP1和GhGRP2归为C端富含半胱氨酸结构域(C-cysteine-rich)类GRP,将GhGRP3归为N端有信号肽的GRP.GhGRP1和GhGRP2都含有12个GGX(此处X代表P/W/F)重复,GhGRP3含有22个GGX(此处X代表A/F/V/L/T/P)重复.此外,它们还含有不同数量GX,GGGX等的重复.实时RT-PCR分析表明,GhGRP1在花药中优势表达.GhGRP2在10dpa(day post anthesis)胚珠中表达最强,10dpa纤维和下胚轴次之,而在花药、根和花瓣中表达量相对较低.GhGRP3在花药,根和下胚轴中表达量较高,而在子叶,花瓣、纤维和胚珠中表达较低.上述结果表明,GhPRP基因家族的不同成员可能分别在棉花不同组织细胞的发育过程中发挥作用.

母体日粮蛋白水平对仔猪抑肌素基因表达量及肌纤维直径的影响

试验选择15头荷包后备母猪,采用实时荧光定量PCR技术,研究妊娠期母体不同蛋白水平日粮对仔猪抑肌素基因表达量及肌纤维直径的影响。结果表明:母体日粮蛋白水平对仔猪抑肌素基因的表达量影响虽不显著(P>0.05),但低蛋白水平有促进仔猪抑肌素基因表达的趋势;母体日粮蛋白水平对仔猪肌纤维直径具有显著的影响(P<0.05),低蛋白水平可以降低仔猪肌纤维直径;抑肌素基因表达量与肌纤维直径呈显著负相关(P<0.05)。

生长素结合蛋白ABP1基因在棉纤维伸长中的功能

以‘湘杂棉14’为材料,采用RT–PCR方法克隆了棉花ABP1基因全长cDNA序列。序列全长792 bp,与GenBank中陆地棉ABP1基因序列的同源性为99%。半定量分析表明,该基因在棉花叶、花及纤维中都有表达,其中叶中的表达量最高,花和纤维中的表达量稍低。ABP1基因在纤维快速伸长期表达水平较高,纤维发育的其他时期的表达水平较低。将ABP1基因cDNA构建成棉花ABP1过表达载体,并以NPT II作为选择标记,经农杆菌介导转化棉花,获得了6株Kan抗性植株,其中3株ABP1表达水平提高。ABP1过表达植株生长发育正常,但纤维长度变化不显著,说明ABP1棉纤维细胞中提高表达水平对其细胞伸长没有显著作用。

棉花GhSP1L基因克隆与表达分析

【目的】棉花Spiral1-LIKE(SP1L)基因(Gh SP1L)的克隆、功能序列分析及原核表达。【方法】通过RT-PCR从棉纤维中克隆Gh SP1L基因,进行Gh SP1L蛋白的功能结构域分析,构建原核表达载体p ET28a-GhSP1L,进行蛋白体外诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达情况;RT-PCR检测Gh SP1L基因的表达特征。【结果】从陆地棉纤维组织中克隆得到Gh SP1L基因的全长c DNA,其开放读码框为318 bp,编码106个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为11.76 k Da。对氨基酸序列进行生物信息学分析,其N端和C端较为保守,含有SCOP结构域,属于SP1L家族蛋白,能够在其他微管蛋白协助下与微管结合,SPR1的定位可能与其结合的微管结合蛋白相关。构建了p ET28a-Gh SP1L原核表达载体,并通过体外诱导表达后获得分子质量约为12 k Da左右的重组蛋白Gh SP1L;半定量RT-PCR结果表明,Gh SP1L基因开花后3 d的纤维组织中表达量较高。【结论】Gh SP1L基因的克隆、序列分析和表达,重组蛋白的诱导表达,为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础。

一个棉花微管结合蛋白基因GhSP1L5的克隆及表达分析

利用RT-PCR技术从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克隆得到Spiral1-Like(SP1L5)基因(GhSP1L5),其开放读码框为315 bp,编码105个氨基酸的蛋白质,生物信息学分析表明,GhSP1L5蛋白N端和C端较为保守,并含有SCOP结构域,是典型的微管结合蛋白。进化树分析表明该基因与SP1L5家族基因的亲缘关系较近。构建原核表达载体pET28a-GhSP1L5,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达,获得分子质量约为12 kD的重组蛋白。QRTPCR结果分析表明GhSP1L5基因在开花后15和20 dpa的纤维组织中表达量较高,在棉纤维发育的其他时期及根、茎、叶组织中表达量较低。

Fhl1基因敲除对不同年龄小鼠腓肠肌肌纤维分化和自噬水平的影响

目的探索Fhl1(Four and a half LIM domains protein 1)基因敲除(Fhl1-ko)对不同年龄小鼠腓肠肌肌纤维分化和自噬水平的影响。方法以2.5月龄和8月龄的野生型和Fhl1-ko型雄性小鼠为研究对象,应用Western blotting技术检测自噬标记物P62(general transcription factor IIH subunit1), LC3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta)和Beclin1在小鼠腓肠肌中的表达情况。应用定量PCR技术检测不同类型的肌纤维在小鼠腓肠肌中的表达情况。结果与野生型2.5月龄的腓肠肌相比, Fhl1-ko小鼠腓肠肌中LC3BⅡ和Beclin 1明显增加, P62却并没有明显降低。而与野生型8月龄的腓肠肌相比, Fhl1-ko小鼠腓肠肌中LC3BⅡ明显增加, Beclin1表达水平改变没有统计学意义, P62的表达水平明显增加。在2.5月龄鼠中, Fhl1-ko可以明显降低腓肠肌中MYHⅡA, MYHⅡX型肌纤维相对表达量,明显增加MYHⅡB型肌纤维相对表达量。在8月龄鼠中, Fhl1-ko基因敲除可以明显增加腓肠肌中MYHⅠ和MYHⅡA型肌纤维相对表达量。结论 Fhl1-ko对不同年龄小鼠腓肠肌肌纤维分化和自噬水平的影响不同,提示调节自噬水平可能是FHL1基因突变和蛋白缺失所致的骨骼肌肌病的潜在治疗手段,并且针对不同年龄段的患者应采用差异化的精准治疗手段。

陆地棉纤维中GhGMPase2基因克隆、序列分析及原核表达

从陆地棉纤维中克隆GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GhGMPase2)基因,并进行序列分析及原核表达。利用RT-PCR技术进行基因克隆,构建原核表达载体pET28a-GhGMPase2并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。研究结果表明,从陆地棉花纤维中克隆得到棉GhGMPase2基因,该基因的开放读码框为1 086bp,编码包含362个氨基酸的蛋白质,分子质量约为40ku。序列分析结果表明,GhGMPase2蛋白具有较高的保守性,具有典型的糖酰基转移酶转移酶A家族(GT-A)结构域和左手平行的β-的螺旋(LbetaH或LBH)域,它们分别属于糖酰基转移酶家族2(GT-2)超家族和LBH超家族。进化树分析的结果显示,棉花GhGMPase2与烟草NtGMPase在进化上亲缘关系较近。经过原核表达载体pET28a-GhGMPase2的诱导表达和SDS-PAGE分析显示,获得分子质量约为40ku的重组GhGMPase2蛋白。GMPase2基因的克隆、序列分析及原核表达为进一步研究其参与棉花纤维发育过程中的重要功能奠定基础。

棉花GhGGPase基因克隆、序列分析及原核表达

【目的】棉花GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GhGGPase)基因的克隆、功能序列分析及原核表达。【方法】利用RT-PCR技术从棉花纤维中克隆棉花GhGGPase基因,进行生物信息学分析,构建原核表达载体pET28a-GhGGPase,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。【结果】从陆地棉纤维组织中扩增得到L-半乳糖磷酸化酶基因的cDNA开放读码框为1 350 bp,为包含450个氨基酸的蛋白质,理论分子质量为49 kDa。对氨基酸序列进行生物信息学分析,GhGGPase蛋白具有组氨酸三聚体(HIT)蛋白超家族的主要特性的结构域。进化树分析的表明棉花GhGGPase与柑橘CuGGPase在进化上亲缘关系上较近。成功构建了pET28a-GhGGPase原核表达载体;获得分子质量约为49 kDa左右的重组蛋白GhGGPase。半定量RT-PCR的组织表达特异性分析表明GhGGPase基因与棉纤维的快速伸长发育密切相关。【结论】GhGGPase基因的克隆、序列分析和重组蛋白的诱导表达为深入研究该基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础。

陆地棉LTP家族基因的克隆与表达分析

长链脂肪酸能够通过调节胚珠内源乙烯信号变化来促进棉花的起始和伸长发育,为深入了解棉花脂肪酸的转运过程及参与基因,对棉花全基因组进行了分析,克隆了11个脂质转运蛋白。实时荧光定量PCR证实:LTP6,LTP7,LTP9,LTP11 4个基因在纤维起始时期(野生型与突变体之间)的表达存在差异,这4个基因可能与纤维起始发育有关。通过基因组步移技术克隆了Gh-LTP6基因的启动子,并对其结构进行分析,发现其具有多个MYB结合位点。这些结果为深入研究LTP基因在纤维起始过程中的角色奠定了基础。

ODF2基因敲减对小鼠精子活力和生育力的影响

目的:探讨外周致密纤维蛋白2(ODF2)基因敲减对小鼠精子活力和生育力的影响。方法:构建了3个携ODF2目的基因的基因敲减腺病毒载体及一个空载对照载体。感染ICR小鼠后,通过RT-PCR和Western印迹实验从3个目标载体中确定敲减效果最佳的载体。用此载体感染小鼠,分析基因敲减小鼠多项精子运动参数、睾丸组织病理以及小鼠产仔情况。结果:用敲减效果最佳的载体感染小鼠发现,基因敲减小鼠的精子多项运动参数显著低于正常对照组,睾丸组织生理结构出现异常,产仔数与对照组比较下降明显[(10.86±1.28)只vs(12.72±2.05)只,P=0.001]。结论:ODF2基因表达减少的确会造成小鼠精子多项运动参数异常、睾丸生理结构异常和生育力下降。