本研究旨在通过TB Green Real-time PCR的方法对国内6个省(四川省、山西省、河南省、河北省、江苏省和内蒙古自治区)的9个规模化养牛场140份以流鼻涕、发热、咳嗽、呼吸困难为特征的病牛呼吸道鼻拭子样本开展牛腺病毒3型(bovine adenovi...本研究旨在通过TB Green Real-time PCR的方法对国内6个省(四川省、山西省、河南省、河北省、江苏省和内蒙古自治区)的9个规模化养牛场140份以流鼻涕、发热、咳嗽、呼吸困难为特征的病牛呼吸道鼻拭子样本开展牛腺病毒3型(bovine adenovirus type 3,BAdV-3)感染状况调查,并对其中的阳性样本进行fiber轴区基因检测。结果显示,140份样品中BAdV-3阳性率为36.4%,除河北省以外,其余各省均有BAdV-3检出,其中,四川及河南省检出率最高,分别达到82.9%(29/35)和83.3%(10/12)。其中,传统型占总阳性比的80.4%,fiber轴区缺失毒株占总阳性样本的19.6%。缺失位置与数量一致,轴区连续缺失237个碱基对(79个氨基酸),且缺失型仅在四川和河南两省检出,检出率分别为24.1%(7/29)和30%(3/10),场群阳性率分别为100%(2/2)和100%(1/1)。结果表明,BAdV-3已在我国牛场中广泛分布,目前流行的主要以传统型毒株为主,fiber轴区缺失毒株在我国具有独特的地域分布,主要在四川和河南省流行。展开更多
本研究旨在对临床1份腹泻病料进行病原的分离培养并探究该病原编码的主要抗原蛋白的生物学特点。采用巢式PCR检测病料猪腺病毒3型(Porcine adenovirus type 3,PADV3)核酸并进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)进...本研究旨在对临床1份腹泻病料进行病原的分离培养并探究该病原编码的主要抗原蛋白的生物学特点。采用巢式PCR检测病料猪腺病毒3型(Porcine adenovirus type 3,PADV3)核酸并进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)进行病毒血清学鉴定,PCR扩增fiber基因,将其ORF区克隆至pET-28a(+)载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组fiber蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体并测定抗体免疫活性。结果表明,病料为PADV3核酸阳性,感染ST细胞产生典型的“葡萄串”细胞病变效应(CPE),P5~P11代次中的PADV3核酸稳定,分离的毒株P5代为PADV3型血清学阳性,fiber基因开放阅读框(ORF)为1296 bp(GenBank登录号:MT774498),与PADV3毒株的核苷酸相似性最高(86.1%),与其他毒株相似性均低于40%;原核表达的重组fiber蛋白分子质量为45.2 ku,fiber蛋白多克隆抗体与PADV3感染的细胞呈特异性的细胞核染色。本试验成功分离得到1株PADV3毒株,命名为PADV3-HY1812,所制备的fiber蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性。展开更多
为建立鸽I型腺病毒(PIAdV-I)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-I Fiber 2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-I的SYBR Green I荧光定量PCR(qPCR)方法。建立的SYBR Green I qPCR方法的标准曲线结果显示,...为建立鸽I型腺病毒(PIAdV-I)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-I Fiber 2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-I的SYBR Green I荧光定量PCR(qPCR)方法。建立的SYBR Green I qPCR方法的标准曲线结果显示,重组质粒标准品pMD19-Fiber在1×10^(3)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL时和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R~2=0.995,扩增效率为90%。利用建立的qPCR方法对鸽II型腺病毒(PIAdV-II)Fiber 2基因保守区质粒标准品、鸽圆环病毒(PICV)、新城疫病毒(NDV)、多杀性巴氏杆菌(PM)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的检测结果均为阴性,仅PIAdV-I检测为阳性,特异性强;该方法对浓度为1×10^(0)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL的重组质粒标准品进行检测,结果显示最低检测限为1×10^(2)拷贝/μL,而普通PCR最低检测限为1×10^(4)拷贝/μL,表明qPCR方法的敏感性更强;该方法批内、批间重复性试验的变异系数分别小于1%和2%,重复性好。利用建立的qPCR方法和普通PCR方法对从呼和浩特市某赛鸽公棚随机采集的30份鸽肝脏样品进行PIAdV-I检测,结果显示前者的阳性检测率为63.3%(19/30),普通PCR方法的阳性率为36.7%(11/30),两种方法的阳性符合率均为100%。本研究首次建立PIAdV-I的q PCR检测方法,为鸽PIAdV-I的感染提供了敏感、快速的检测手段。展开更多
文摘本研究旨在通过TB Green Real-time PCR的方法对国内6个省(四川省、山西省、河南省、河北省、江苏省和内蒙古自治区)的9个规模化养牛场140份以流鼻涕、发热、咳嗽、呼吸困难为特征的病牛呼吸道鼻拭子样本开展牛腺病毒3型(bovine adenovirus type 3,BAdV-3)感染状况调查,并对其中的阳性样本进行fiber轴区基因检测。结果显示,140份样品中BAdV-3阳性率为36.4%,除河北省以外,其余各省均有BAdV-3检出,其中,四川及河南省检出率最高,分别达到82.9%(29/35)和83.3%(10/12)。其中,传统型占总阳性比的80.4%,fiber轴区缺失毒株占总阳性样本的19.6%。缺失位置与数量一致,轴区连续缺失237个碱基对(79个氨基酸),且缺失型仅在四川和河南两省检出,检出率分别为24.1%(7/29)和30%(3/10),场群阳性率分别为100%(2/2)和100%(1/1)。结果表明,BAdV-3已在我国牛场中广泛分布,目前流行的主要以传统型毒株为主,fiber轴区缺失毒株在我国具有独特的地域分布,主要在四川和河南省流行。
文摘为建立鸽I型腺病毒(PIAdV-I)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-I Fiber 2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-I的SYBR Green I荧光定量PCR(qPCR)方法。建立的SYBR Green I qPCR方法的标准曲线结果显示,重组质粒标准品pMD19-Fiber在1×10^(3)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL时和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R~2=0.995,扩增效率为90%。利用建立的qPCR方法对鸽II型腺病毒(PIAdV-II)Fiber 2基因保守区质粒标准品、鸽圆环病毒(PICV)、新城疫病毒(NDV)、多杀性巴氏杆菌(PM)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的检测结果均为阴性,仅PIAdV-I检测为阳性,特异性强;该方法对浓度为1×10^(0)拷贝/μL^(1)×10^(8)拷贝/μL的重组质粒标准品进行检测,结果显示最低检测限为1×10^(2)拷贝/μL,而普通PCR最低检测限为1×10^(4)拷贝/μL,表明qPCR方法的敏感性更强;该方法批内、批间重复性试验的变异系数分别小于1%和2%,重复性好。利用建立的qPCR方法和普通PCR方法对从呼和浩特市某赛鸽公棚随机采集的30份鸽肝脏样品进行PIAdV-I检测,结果显示前者的阳性检测率为63.3%(19/30),普通PCR方法的阳性率为36.7%(11/30),两种方法的阳性符合率均为100%。本研究首次建立PIAdV-I的q PCR检测方法,为鸽PIAdV-I的感染提供了敏感、快速的检测手段。
