基于蛋白酶活力的地龙酒制工艺优选

目的优化地龙酒制工艺。方法采用纤维蛋白平板法检测酶活力;以炮制温度、炮制时间、加酒量和焖润时间为考察因素,以蚯蚓纤溶酶活力为考察指标,采用L_(9)(3^(4))正交试验法优选地龙酒制工艺参数。结果每100kg地龙,加黄酒12.5kg拌匀,焖润30min,70℃翻炒2min时,其酶活力最高(每克31.8万单位)。结论该炮制工艺稳定、可行,可用于地龙的酒制。

纳豆激酶分离纯化与鉴定

为了提高纳豆激酶的溶栓活性 ,从纳豆粗提物中分离纯化了纳豆激酶。采用Butyl Toyopearl柱层析对纳豆粗提物进行了分离纯化 ,以试管法确定和收集了活性部位 ,用纤维蛋白平板法测定了活力 ,并用十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS PAGE)对分离纯化的效果进行了检验。考察了纳豆激酶粗提物在不同温度和湿度条件下的稳定性。结果表明在SDS PAGE中观察到三条明显的蛋白谱带 ,其中相对分子质量为 192 75和 2 710 1的区带具有与文献报道类似的纳豆激酶的相对分子质量和纤溶活性 ,而相对分子质量为 14 4 0 0的蛋白区带与文献报道的纳豆激酶的相对分子质量大有差异。纯化倍数为 5 0倍 ,活性回收率为 75 .5 7%。初步稳定性实验结果表明 :其外观在 4 0℃和 6 0℃保存条件下发生变化 ,纤溶活力在 6 0℃保存条件下发生显著变化。而 4℃条件下活力和外观却很少有变化 ;纳豆粗提物在不同湿度条件下均具有较强吸湿性。纳豆粗提物对高温和高湿稳定性较差。

两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析

从线性和精密度两个方面对纤维蛋白平板法和四肽底物法测定纳豆激酶活性的两种方法进行了比较研究,并验证了两种方法测定值之间的直线相关性。结果表明:纤维蛋白平板法和四肽底物法分别在10.77IU/mL～80.73IU/mL和0.03U/mL～0.09U/mL浓度范围内呈线性,且日间和日内变异系数均小于10%。两者结果具有直线相关性,其关系为纤维蛋白平板法测定值(IU)=264.87×四肽底物法测定值(U)-19.633,(R2=0.9942)。结论:纤维蛋白平板法与四肽底物法均能用于纳豆激酶活性测定,前者测定结果直接,但四肽底物法更灵敏,还可应用于高通量筛选。

大孔吸附树脂提取中药地龙中蚓纤维蛋白溶酶的研究

为研究大孔吸附树脂提取中药地龙中蚓纤维蛋白溶酶,通过对 6种树脂的吸附容量,吸附平衡时间,洗脱液等条件进行考察,筛选出了D4020和D3520两种分离效果较好的树脂。

响应面法优化固载纳豆菌发酵鹰嘴豆工艺

采用响应面法确定固载纳豆菌发酵鹰嘴豆的最佳工艺条件,为发酵鹰嘴豆的进一步开发利用提供技术参考。在单因素试验的基础上,以pH值、发酵时间和发酵温度为影响因素,以发酵鹰嘴豆的溶栓活力为响应值,根据中心组合试验原理设计(Central Composite Design)3因素3水平响应面试验,对固载纳豆菌发酵鹰嘴豆的工艺进行优化。通过响应面分析建立发酵鹰嘴豆溶栓活力(Y)对pH值(A)、发酵时间(B)、发酵温度(C)的二次回归模型:Y=1861.47-74.56A+305.50B-28.82C+203.66AB+30.82AC-18.16BC-244.11A^2-203.68B2-70.64C^2(R^2=0.9981),模型的拟合程度良好,其中pH值、发酵时间、发酵温度对发酵鹰嘴豆的溶栓活力均有极显著的影响(P<0.01),pH值与发酵时间的交互作用对发酵鹰嘴豆的溶栓活力也有极显著的影响(P<0.01),pH值与发酵温度的交互作用对发酵鹰嘴豆的溶栓活力则表现出显著的影响(P<0.05)。固载纳豆菌发酵鹰嘴豆的最佳工艺条件为:在pH 6.5、发酵时间58.5h、发酵温度37.5℃的条件下进行发酵,得到的发酵鹰嘴豆的溶栓活力达1976.24IU/g,与理论预测值1989.13IU/g接近。采用响应面法优化固载纳豆菌发酵鹰嘴豆工艺溶栓活力良好,优化后的新工艺可在实际生产中推广应用,并作为新型溶栓保健功能食品大规模在市场上推广。

基于分光光度法构建纳豆激酶纤溶活性快速测定方法

为建立一种快捷、有效的纳豆激酶纤溶活性测定方法,在研究纤维蛋白平板法的基础上,构建了以透明圈面积为中间参数的纳豆激酶纤溶活力与吸光度值之间关系模型,通过测定纳豆激酶显色反应中的吸光度值,直接获得纳豆激酶的纤溶活性。结果显示改进后的酪蛋白方法可行,其模型方程为y=1877.77x-481.08(R2=0.9924)。验证结果显示模型相关性强,准确度较高,操作简便、快速、检测成本低,是一种高效的纳豆激酶纤溶活性快速检测方法。

一种改良的纤维平板法

介绍一种改良的用以快速地定性和半定量检测纤溶活性蛋白的纤维平板法.对该方法中的几个关键因素作了详细的研究和探讨.纤维平板中纤维蛋白原和纤溶酶原的浓度对裂解面积不产生任何影响,但是纤维蛋白原的浓度会对裂解圈的观察产生影响,纤维蛋白原浓度低于0.2 mg/mL时会使背景色过淡而不能清晰地观察到裂解圈.尿激酶浓度在2～250 mU/μL范围时,尿激酶浓度的对数和裂解圈相互垂直的两条直径乘积的对数之间存在明显的线性关系.在本实验设计方案下,尿激酶的最佳使用浓度为10～20 mU/μL.同时,本文还探讨了纤维平板中纤溶酶原的去活条件,当琼脂纤维平板凝固后很难完全去活纤溶酶原,但是,在琼脂纤维蛋白原混合物凝固前于95℃持续温浴40 min,则能彻底去活纤维蛋白原中残留的纤溶酶原.

蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的优化表达及活性鉴定

alfimeprase(ALF)是蛇毒纤溶酶fibrolase的N端突变体,有纤溶活性而无出血活性。通过双酶切从克隆载体上获取目的基因alf,将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA,经高效电转化、Zeocin筛选鉴定及培养条件pH、每天甲醇流加终浓度、菌体生长密度和甲醇诱导时间的优化,获得了重组ALF(rALF)高表达菌株pPICZαA-alf/GS115,且在优化条件下rALF的最高产量达425mg/L。通过His.bind柱纯化后,rALF纯度高达95%。SDS-PAGE和Western blot分析表明rALF的分子量约为24kDa,且能与一抗特异结合。纤维蛋白平板法纤溶活性鉴定结果说明rALF获得了高活性分泌表达,即确立了一种优化表达体系,为ALF的深入研究和工业化生产应用奠定了重要基础。

重组纳豆激酶工程酵母菌发酵研究

利用在纤维蛋白平板法基础上进行改造的纤维蛋白原—琼脂糖平板法,筛选具有纳豆激酶活性的基因工程酵母菌。并用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶纤溶活性。通过甲醇诱导从近100个菌落中筛选出5株纳豆激酶活性较高的重组纳豆激酶工程菌。同时确定了重组纳豆激酶酵母菌的最佳甲醇诱导浓度2%,产酶高峰时间为96h。

广地龙药材中蚓激酶的生物活性测定

目的采用纤维蛋白原平板法建立广地龙药材中蚓激酶的生物活性测定方法。方法以纤维蛋白原为底物,与琼脂糖和凝血酶按比例混匀制成纤维蛋白原平板。以蚓激酶标准品在该平板上的扩散反应,制作标准曲线及回归曲线,并对蚓激酶的生物活性进行定量测定。结果蚓激酶的标准曲线线性关系良好(r≥0.9998),同板精密度的RSD为5.02%,异板精密度的RSD为3.11%,重复性和稳定性的RSD值均为2.98%;平均回收率为100.11%,RSD为7.84%。表明该方法准确,稳定性、重复性良好。结论纤维蛋白平板法可用于广地龙药材中蚓激酶的含量测定。

人血清白蛋白修饰的尿激酶与天然尿激酶的家兔体内过程比较

家兔静注人血清白蛋白修饰的尿激酶(MUK)和天然尿激酶(NUK)40000IU后,MUK 的体内过程符合零级速率过程,NUK 则符合一级速率过程,血纤溶活性 MUK 持续100min,而 NUK 仅20~25min。在“功能性”去除肝肾的家兔,NUK 血浓度半衰期延长3~4倍,而 MUK 血浓度下降与正常家兔相似。MUK 及 NUK 在去除纤溶抑制物的优球蛋白成份中纤溶活性相似,但在血浆中 NUK 仅存24~35%的纤溶活性,MUK 则保留了64~85%的纤溶活性。提示肝肾的摄取、代谢和消除能力降低及对血浆纤溶抑制物抵抗力增强,是 MUK 血纤溶活性长时间维持高水平的主要原因。

超声波提取地龙抗血栓部位的工艺研究

通过提取方式选择和正交设计法对地龙的抗血栓部位进行超声波提取,以纤溶酶活性和干膏率为指标,分别对料液比、提取温度、提取时间等因素进行考察,优选出最佳工艺条件为:以水为提取溶剂,料液比1∶12/1∶10,提取温度25℃,提取时间40min;验证试验表明工艺稳定可行。

地龙体外抗凝血部位的制备工艺研究

目的:采用体外活性评价法,研究地龙基于膜分离技术抗凝血部位的制备工艺。方法:以蛋白质含量和酶活性为指标,采用单因素考察和正交试验优选地龙的提取、精制、浓缩工艺。结果:地龙体外抗凝血部位的制备工艺为地龙粗粉加入15倍量0.9%NaC l溶液,37℃超声提取3次,每次40 m in;将上述提取液经30×103超滤膜进行精制,超滤液经10×103超滤膜进行浓缩。结论:超声提取技术与膜分离技术相结合,能够提高地龙抗凝血部位的分离纯化效果,有利于活性部位的进一步研究。

淡豆豉炮制过程中产纤溶酶微生物的筛选和鉴定

目的筛选和鉴定淡豆豉炮制过程中产纤溶酶的优势菌株。方法按《中国药典》2020年版制备淡豆豉;采用酪蛋白平板法和纤维蛋白平板法分别对淡豆豉炮制不同时间点样本中产纤溶酶的微生物进行初筛和复筛;将产纤溶酶微生物分别接种在特定的液体培养基中培养,获得纯种发酵液,用纤维蛋白平板法测定发酵液的纤溶酶活力;应用16S rDNA和18S rDNA通用引物分别对产纤溶酶细菌和真菌进行PCR扩增、对扩增产物进行测序,测序结果通过NCBI同源性比对、MEGA4.1软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定。结果筛选获得3种产纤溶酶细菌,分别为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia、微球菌Micrococcus。纤维蛋白平板法测定纯种发酵液纤溶酶活力的结果显示,嗜麦芽窄食单胞菌所产纤溶酶活力最高,达527.49 IU/mL。结论淡豆豉炮制过程中存在高产纤溶酶的优势菌株,淡豆豉的溶栓作用值得进一步研究。为揭示淡豆豉炮制中纤溶酶形成机制奠定基础。

多指标综合评分法优选地龙水提纯化工艺

目的：优选地龙的提取纯化工艺。方法：分别采用考马斯亮蓝法、纤维蛋白平板法测其蛋白质含量和蛋白酶活性,结合得膏率,用正交试验考察地龙的提取工艺;采用微波消解样品,氢化物原子吸收法测定砷含量。结果：蚓激酶在2 000-10 000 U·m L^-1与溶圈面积呈良好线性关系,地龙的提取工艺为地龙粗粉加入8倍量水浸泡30 min,超声提取3次,每次30 min,高速离心法纯化效果最佳。结论：优选参数稳定可行,为地龙有效成分的充分利用提供新选择。

纤维蛋白平板法测定保健食品中纳豆激酶活力

目的:采用适宜方法,测定保健食品中的纳豆激酶活力。方法:应用纤维蛋白平板法,测定保健食品中的纳豆激酶活力。结果:在20 IU/ml～100 IU/ml浓度范围内,尿激酶活力与透明圈面积呈线性关系,且精密度与准确度良好,变异系数小于10%,加标回收率为94%。结论:纤维蛋白平板法适宜测定保健食品中纳豆激酶活力,方法简便、实用。并讨论了一些改进措施及注意事项。

正交试验设计优选银杏内酯体外纤溶活性最佳配比

目的:采用体外活性评价法,研究5种银杏内酯的纤溶活性。方法:利用纤维蛋白平板法以银杏内酯的酶活力为指标,采用L16(215)正交试验设计从5种银杏内酯中筛选出最佳的溶栓药物组合,并确定最佳比例。结果:本研究发现银杏内酯A(ginkgolide A,GA)、银杏内酯B(ginkgolide B,GB)、银杏内酯C(ginkgolide C,GC)具有良好的溶栓效果,其最佳配比为GA∶GB∶GC=1∶3∶2。结论:本研究采用纤维蛋白平板法测定银杏内酯的纤溶活性,该方法准确,操作简便,成本低,可用于银杏内酯的溶栓作用研究。

纤溶活性蛋白检测方法研究进展

迄今为止,对纤溶活性蛋白(fibrinolytic protein)的检测主要有4种方法:纤维平板法(fibrinplate method)、显色底物法(colorimetric assay using chromogenic substrates)、反相纤维蛋白自显影法(reverse fibrin autography)和纤维蛋白酶谱法(fibrin zymography)。纤维平板法可以用来快速判断样品是否具有纤溶活性,同时,纤维平板法和显色底物法也可以用来对纤溶活性蛋白进行半定量分析。反相自显影法和纤维蛋白酶谱法则是两种较新的技术,主要用来对纤溶活性蛋白进行定性分析。详细阐述了这几种技术的发展过程、原理、优缺点和应用范围。

六种广西道地药材的体外纤溶活性研究

目的:研究六种广西道地药材的体外纤溶活性。方法:采用纤维蛋白平板法,对罗汉果、葛根、天花粉、金银花、姜黄和广金钱草的不同提取液进行体外纤溶活性研究;用大孔吸附树脂柱对广金钱草热水提取物进行分离,并对不同洗脱部位进行体外纤溶活性筛选;用化学定性方法对广金钱草的纤溶活性部位进行化学成分检测。结果:葛根和金银花的冷水超声提取液,天花粉的热水提取液和冷水超声提取液,广金钱草的热水提取液、冷水超声提取液和20%乙醇超声提取液均有体外纤溶作用;广金钱草大孔树脂柱层析的水洗脱部位具有稳定的体外纤溶活性;广金钱草热水提取物和水洗脱前部位的Fehling反应、Molish反应、泡沫试验、三氯化铁试验、溴甲酚绿试验和盐酸-镁粉反应均为阳性;水洗脱后部位的Fehling反应、Molish反应、三氯化铁试验和盐酸-镁粉反应均为阳性,而溴甲酚绿试验和泡沫试验为阴性反应。结论:葛根、天花粉、金银花和广金钱草都具有一定的体外纤溶活性,以广金钱草的纤溶活性最强;广金钱草的纤溶活性成分很可能是还原糖、多糖、鞣质、有机酸、皂苷或黄酮苷。

中国传统发酵食品中溶栓酶活性检测方法比较

通过正交实验设计建立最佳琼脂糖-纤维蛋白平板法,并比较改进的纤维蛋白平板法和四肽底物法测定中国传统发酵食品中溶栓酶的活力的线性和精密度,以找出一个灵敏易操作、经济实惠、快速准确地标示溶栓酶效价的活性检测方法。实验结果显示纤维蛋白平板法和四肽底物法分别在50～800IU.mL-1、0.03～2.60U.mL-1范围内具有良好的线性关系,且日间和日内变异系数均小于6%。因此,纤维蛋白平板法与四肽底物法均能用于溶栓酶的活性检测,前者测定结果比较直观,但四肽底物法操作比较简单,经济成本相对较低,灵敏度高,更适合溶栓菌株的高通量筛选。