转录因子POU2F2通过激活Sestrin2对缺血性脑卒中后癫痫铁死亡的保护作用及机制

目的 探讨敲减POU转录因子家族2级同源框2(POU2F2)对缺血性脑卒中后癫痫(PISE)的影响及机制。方法 利用生物信息学方法预测并分析POU2F2和Sestrin2(Sesn2)启动子结合位点;雄性Wistar大鼠随机分为Sham组、PISE组、PISE+LV-shNC组和PISE+LV-shPOU2F2组,四血管闭塞(4-VO)法建立PISE模型;健康大鼠大脑皮层中分离原代神经元,无镁处理法构建体外细胞PISE模型,随机分为对照组、PISE组、PISE+shNC组、PISE+shPOU2F2组和PISE+shPOU2F2+Sesn2组。qRT-PCR检测POU2F2和Sesn2 mRNA表达;Western blot检测POU2F2、Sesn2和GPX4蛋白表达;试剂盒检测活性氧(ROS)、脂质ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀(ChIP)检测POU2F2对Sesn2启动子转录活性的影响。结果 JASPAR转录因子预测结果显示Sesn2启动子区与转录因子POU2F2存在结合位点。qRT-PCR和Western blot结果显示,与对照组比较,PISE组大鼠和原代皮层神经元POU2F2和Sesn2 mRNA和蛋白均表达增多(P<0.05);与PISE+shNC组比较,PISE+shPOU2F2组大鼠和神经元POU2F2和Sesn2 mRNA和蛋白均表达降低(P<0.05)。与对照组比较,PISE组大鼠脑组织ROS产生、原代皮层神经元脂质ROS积累、LDH活性和MDA含量显著增加,GSH含量和GPX4蛋白表达明显降低(P<0.05);与PISE+shNC组比较,沉默POU2F2可进一步增加大鼠脑组织ROS产生和原代皮层神经元脂质ROS积累、LDH活性和MDA含量,降低GSH含量和GPX4蛋白表达(P<0.05)。双荧光素酶报告基因技术和ChIP实验证实POU2F2可调控Sesn2启动子的活性。过表达Sesn2后,PISE+shPOU2F2+Sesn2组较PISE+shPOU2F2组神经元脂质ROS积累、LDH活性和MDA含量降低,GSH活性增加(P<0.05)。结论 PISE可诱导POU2F2和Sesn2的代偿性增加,抑制POU2F2可通过降低Sesn2表达促进铁死亡而加剧PISE,这为PISE的治疗机制提供了新的视角。

鸭IL-2基因启动子的克隆、多态性与表达的关联分析

为研究鸭IL-2基因调控区单核苷酸多态性对其转录调控的影响,克隆获得了鸭IL-2基因启动子2850 bp序列,与人、小鼠和原鸡的同源性分别为35.37%,37.52%和34.74%。其中,-1 400/-1 000存在集中的核心转录因子结合位点。对鸭IL-2基因启动子(-1 932/-742)进行单核苷酸多态检测和遗传多态性分析发现,该区域存在两个突变位点(C-1353A、C-1406T),且均处于Hardy-Weinberg极不平衡状态;等位基因A均为优势等位基因。单核苷酸多态与其表达水平的相关性分析发现,突变位点不同基因型与IL-2基因mRNA表达水平和IL-2蛋白水平均无显著相关关系,但基因型AA个体的mRNA表达量均高于其他基因型个体(P>0.05),表明鸭IL-2启动子等位基因A可能有促进IL-2基因转录的趋势。研究结果为IL-2基因转录调控机制的研究提供了理论基础。

猪圆环病毒2型对外周血单核细胞中PD-1,PD-L1和IL-21转录水平的影响

用猪圆环病毒2型(PCV2)体外感染外周血单核细胞,建立荧光定量PCR方法检测PCV2的病毒载量;同时,在PCV2感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72h收集细胞,抽提RNA进行反转录,检测PD-1、PD-L1和IL-21的转录水平变化,分析评价PCV2感染对PD-1、PD-L1和IL-21的转录水平变化的影响。结果显示,PD-1在感染外周血单核细胞后72 h显著升高,达到峰值;PD-L1在感染后转录水平都显著升高,48 h达到峰值;IL-21在感染后48 h转录水平最低。结果表明,PCV2不仅能够在体外感染外周血单核细胞,而且随着病毒载量的增加,导致PD-1、PD-L1和IL-21的转录水平显著升高。以上结果表明,PCV2感染导致PD-1、PD-L1和IL-21的转录水平升高,通过激活PD-1/PD-L1通路,从而抑制IL-21的转录水平;相反,IL-21刺激PD-1、PD-L1的转录水平升高。研究结果为探索PCV2的致病机制和控制PCV2的感染提供了理论基础。

PCV2 Cap蛋白刺激PBMCs中IL-21和IL-17A基因转录水平的变化

为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白能否模拟PCV2在体外刺激外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),使猪白细胞介素21(interleukin-21,IL-21)和IL-17A基因转录水平发生变化,试验根据IL-21和IL-17A的基因序列,设计引物,利用实时荧光定量PCR检测IL-21和IL-17A基因的转录水平。为进一步分析IL-21和IL-17A转录调节的机制,研究还通过实时荧光定量PCR检测了PD-L1的转录水平。结果表明:PCV2 Cap蛋白和PCV2在体外均能刺激PBMCs,导致IL-21、IL-17A和PD-L1基因的转录水平升高,其中PCV2 Cap蛋白导致的IL-21基因转录水平升高更多,几乎是PCV2刺激时表达量的2倍,IL-17A基因的转录水平基本和PCV2刺激时保持一致;PCV2 Cap蛋白能模拟PCV2刺激PD-L1基因转录水平发生变化,但是与PCV2感染时转录水平变化趋势并不完全一致,PCV2刺激时PD-L1的转录水平更高,预示着PD-L1基因与IL-21和IL-17A基因的转录可能存在一定的调节关系。

绿盲蝽毒死蜱抗性和敏感品系乙酰胆碱酯酶-2基因的克隆、序列分析及表达水平

【目的】为了明确绿盲蝽Apolygus lucorum乙酰胆碱酯酶-2(acetylcholinesterase-2,ACh E2)与毒死蜱抗性的关系。【方法】本研究利用RACE技术获得了绿盲蝽ACh E2基因(Al-ace2)的全长序列,并检测了Al-ace2在绿盲蝽毒死蜱抗性品系(BZ-R)及敏感品系(SLF和BZ)中的氨基酸序列多态性及mRNA相对表达量。【结果】Al-ace2开放阅读框长1 935 bp,编码644个氨基酸残基;推导的氨基酸序列含有ACh E的典型结构,如催化三联体、氧阴离子洞、胆碱结合位点及围绕活性位点丝氨酸的保守结构域FGESAG。与两个敏感品系(SLF和BZ)相比,绿盲蝽毒死蜱抗性品系BZ-R Al-ace2基因中存在T552M氨基酸替换,发生频率为5%,但此位点氨基酸并不保守,也不靠近活性位点,推测其与抗性无关。在绿盲蝽SLF,BZ和BZ-R品系中,Al-ace1表达量均约为Al-ace2的3倍,且Al-ace2转录水平在3个品系间无显著差异。【结论】结果说明,在绿盲蝽体内ACh E2是次要表达的乙酰胆碱酯酶,该ACh E2可能与绿盲蝽BZ-R品系对毒死蜱的抗性无关。

SMN2拷贝数和fl-SMN2转录水平对脊髓性肌萎缩症表型及生存的影响

目的探讨运动神经元存活基因2(SMN2)拷贝数及SMN2全长转录本(fl-SMN2)水平在脊髓性肌萎缩症(SMA)1-3型患儿中的分布,明确其对疾病表型、进展及预后评估的意义及影响。方法回顾性分析2019年1月至2021年12月到首都儿科研究所就诊并经基因诊断为SMN1纯合缺失且未经治疗的78例SMA患儿的临床资料,采集患儿的临床横断面数据,包括发病年龄、获得的运动功能、并发症等,并随访采集运动功能退化及生存数据,同时测定患儿携带的SMN2拷贝数和fl-SMN2转录水平,应用t检验或单因素方差分析或χ2检验进行组间比较,Kaplan-Meier分析用于生存分析,Kendall′s tau-c分析这两个标志物与疾病表型、发病年龄、运动进展及结局之间的相关性。结果78例SMA患儿中1型为17例(21.8%),2型34例(43.6%),3型27例(34.6%)。约41.2%(7/17)的1型患儿死亡,中位生存年龄为11个月,2型和3型患儿中未观察到死亡。携带2、3和4个SMN2拷贝患儿的中位发病年龄分别为1.8、12.0和24.0个月(F=4.943,P=0.01),fl-SMN2转录水平均值分别为196.25±68.79、331.21±108.79和455.69±122.27(F=37.154,P<0.001)。2拷贝SMN2的患儿1年、2年和5年时的生存率分别为50.5%、0、0,中位生存期为7个月,而在3拷贝和4拷贝的5年生存率分别为97.4%和100.0%。fl-SMN2转录水平与SMA表型严重程度呈负相关(Kendall′s tau-c=-0.444,P<0.001),且存活患儿的fl-SMN2转录水平(342.93±125.74)明显高于死亡患儿的水平(212.14±92.31)。在运动功能的获得方面均表现出SMN2拷贝数越多,fl-SMN2转录水平越高,获得的运动功能也越多的趋势(P<0.001)。此外,fl-SMN2转录水平在独坐和独站功能未退化组和功能退化组差异有统计学意义(F=5.432,P=0.023;F=4.315,P=0.047)。结论SMN2拷贝数和fl-SMN2转录水平均与SMA表型严重程度和生存状况有关,是评估SMA表型重要的生物标志物。fl-SMN2转录水平还可能与独坐和独站功能的退化相关。

左心室射血功能障碍的心衰患者心房细胞中兰尼碱受体转录水平明显降低

为检测心衰患者心肌细胞中钙离子调节基因的转录水平,探索心力衰竭及左室射血功能(left ventricular ejection fraction,LVEF)受损的分子机制,通过反转录PCR检测钙离子调节基因的转录水平并采用t检验的方法比较了左室射血功能受损组与对照组的差异。结果表明:兰尼碱受体(ryanodine receptor,RyR)转录水平在左室射血功能受损组中的转录水平明显升高,差异具有统计学意义。可见左室射血功能受损的心衰患者,其心肌细胞中RyR转录水平高于左室功能正常的心衰患者,表明RyR参与了左室射血功能的调节。

鱼腥草素钠对BALB/c小鼠的急性毒性及其对细胞的损伤

目的探索鱼腥草素钠(SH)急性毒性及其对腹腔细胞的损伤作用。方法观察BALB/c小鼠单次ip给予SH 50,125和200 mg.kg-1后的急性毒性反应及死亡情况,并进行病理组织学检查。检测小鼠单次ip给予SH后血浆中组胺的浓度。将SH与小鼠腹腔细胞进行体外孵育,检测乳酸脱氢酶(LDH)渗出和组胺释放。观察SH对人血红细胞的溶血作用。结果小鼠单次ip给予SH后,SH 50 mg.kg-1组没有观察到小鼠死亡,SH 200 mg.kg-1组小鼠全部死亡,死亡原因为肝充血。与正常对照组血浆中组胺浓度(45.8±9.6)μg.L-1相比,小鼠ip给予125 mg.kg-1后0.5 h血浆中组胺浓度为(66.1±3.9)μg.L-1,明显增加(P<0.05)。SH 0,32和128 mg.L-1体外处理小鼠腹腔细胞,上清中的相对含量LDH分别为1.2±1.1,19.2±3.3和30.6±3.1,组胺的浓度分别为36.5±9.0,73.3±3.8和(82.7±3.6)μg.L-1,与正常对照组相比明显增加(P<0.05)。溶血实验发现,SH能够引起小鼠及人血红细胞显著的溶血现象。结论 SH对小鼠具有一定的急性毒性,可引起小鼠腹腔细胞LDH和组胺的释放,并且SH具有溶血作用。

USF2与其截短体真核表达载体的构建及对Smurf1/2转录水平的影响

目的构建上游刺激因子2(USF2)及其截短体的真核表达载体,鉴定USF2蛋白中抑制泛素连接酶Smurf1/2转录的功能区域。方法采用PCR技术扩增USF2及其两个截短体USF2(1~235aa)、USF2(236~346aa)编码基因,分别将其构建在pCMV-Myc重组载体上,转染真核细胞后验证其表达,Western blot及实时定量PCR确定USF2下调Smurf1/2转录水平的区域。结果成功地将USF2及其两个截短体编码基因构建至pCMV-Myc载体,并验证其在真核细胞中的正确表达,Western Blot和实时定量PCR实验结果显示,USF2 C端236~346aa区域对Smurf1/2的转录水平有抑制效应。结论 USF2通过其C端236~346aa区域对Smurf1/2的转录产生抑制效应。