哈维氏弧菌FlaA基因的克隆、序列分析及真核表达质粒的构建

哈维氏弧菌是水产病害中常见的致病菌.参照基因库上登录的弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因序列设计简并引物,PCR扩增哈维氏弧菌TS-628株的FlaA全基因,并克隆到pMD 18-T载体中测序,经序列分析该基因全长1 140 bp,编码379个氨基酸.与基因库中其他弧菌的同源基因序列比较显示,哈氏弧菌FlaA基因与霍乱弧菌FlaA基因的同源性最高(79.5%),该基因编码的多肽缺乏半胱氨酸,并在N-,C-两端的氨基酸序列较为保守,中间区域的变异较大.对该蛋白的氨基酸组成及空间结构进行了分析和预测,并推测该蛋白质的平均分子量为40.6 kDa.在该基因末端加上一段编码Flag短肽的核苷酸序列后克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得带哈氏弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因的真核表达重组质粒pcDNA-FlaA-tag,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.

嗜肺军团菌flaA基因DNA疫苗的构建及其免疫保护性研究

目的构建flaA基因的DNA疫苗,观察其对嗜肺军团菌感染的免疫保护作用。方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-flaA上切下flaA基因,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-flaA。将18只BALB/c雌性小鼠随机分为3组,pcDNA3.1-flaA实验组肌肉接种pcDNA3.1-flaA质粒100μg,2w后加强免疫一次,2个对照组分别肌肉注射等体积的生理盐水和100μg空质粒,加强免疫后3w小鼠鼻腔滴注嗜肺军团菌Lp1菌液进行攻击感染,感染4w后,检查小鼠肺组织带菌量,观察肺组织病理形态学改变。结果成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-flaA,攻击感染实验表明,pcDNA3.1-flaA免疫组肺组织带菌量显著少于生理盐水对照组和空质粒对照组(P<0.05),且肺组织病理变化症状较pcDNA3.1对照组和生理盐水对照组的肺轻微。结论由flaA基因构建的嗜肺军团菌DNA疫苗能诱导小鼠产生保护性免疫。

框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株鞭毛flaA基因的克隆与生物信息学分析

以框镜鲤Cyprinus carpio维氏气单胞菌Aeromonas veronii CY0806株细菌基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得flaA基因,将其克隆并测序,测序结果与气单胞菌属的不同菌株进行相似性分析,并对flaA基因编码蛋白质进行生物信息学分析.结果显示:获得框镜鲤维氏气单胞菌鞭毛flaA基因,长915 bp,编码304个氨基酸,系统进化树分析,其与其他维氏气单胞菌flaA基因处于同一分支,相关生物信息学分析显示,flaA基因编码的蛋白质相对分子质量32 098.66,等电点5.57,半衰期30 h,不稳定系数为32.31,脂肪系数81.05,不存在信号肽和跨膜区,二级结构预测:flaA基因以α螺旋和β折叠为主,同时,以同源建模法预测了flaA基因编码蛋白的三维立体结构.

幽门螺杆菌flaA基因表达载体的构建和产物免疫性的鉴定

采用高保真PCR从幽门螺杆菌Y0 6株DNA中扩增全长flaA基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 pET32a的flaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用Hp全菌抗体的westernblot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。所克隆的flaA基因核苷酸和氨基酸序列与文献报道的同源性分别为 96 .2 8%～ 97.13%和 99.4 1%～ 10 0 %。pET32a flaA BL2 1DE3系统表达的FlaA融合蛋白量高达细菌总蛋白的 4 0 %～ 5 0 %。FlaA融合蛋白能与Hp全菌抗体及家兔免疫血清发生结合反应。

猪支气管败血波氏杆菌FlaA基因克隆与序列分析

参考相关资料，针对支气管败血波氏杆菌Bordetella bronchiseptica FlaA基因上游序列选择合成1对特异性引物，对贵州分离株（B8株和B27株）进行PCR扩增，将扩增产物连接在pMD18-T载体上，并转化到DI-L5a感受态细胞中，提取重组质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序。结果获得分子长为237bp的特异性DNA片段；核苷酸同源性分析表明，贵州分离株间的同源性高达99．1％，与Bb参考株的同源性为97．8％～99．6％，与Bpp参考株的同源性为95．6％-97．4％；系统进化树分析表明，贵州分离株与Bb参考株亲缘关系较近，而与Bpp参考株亲缘关系远。

人胃粘膜幽门螺杆菌的flaA基因的变异

我们对52例胃粘膜活检标本和18株 Hp 临床分离株进行 Hp 特异的16S rRNA 基因和鞭毛素 A 基因 PCR 扩增和 PCR-RFLP 及 PCR-RFLP-SSCP 分析,以检测 Hp 鞭毛素 A 基因的变异性,进而研究其与 Hp 致病性的关系。结果对43例 Hp(+)的 flaA 基因 PCR-RFLP(HindⅢ)大约可分7个型(变异检出率为16.3%),而PCR-RFLP-SSCP 可分37个型(变异检出率为86.0%),两者有非常显著性差异。本研究表明,flaA 基因变异性极大,PCR-RFLP-SSCP 是检测其变异的有效方法。

flaA基因的缺失对绵羊脑炎单核细胞增生李斯特菌的细胞黏附、侵袭能力及生物被膜形成能力影响的研究

为了探究flaA基因对单核细胞增生李斯特菌LM90SB_2黏附和侵袭MBMEC、RAW264.7能力、生物被膜(BF)形成能力的影响,本研究分别进行了flaA基因缺失株LM90SB_2-ΔflaA与野毒株LM90SB2对细胞黏附和侵袭试验,定性定量分析了他们生物被膜形成能力以及小鼠不同脏器中载菌量差异。结果显示:LM90SB_2-ΔflaA对MBMEC的黏附菌数较野毒株LM90SB_2低,且两者差异性显著(P<0.05),两者对MBMEC的侵袭数差异性不显著(P>0.05),而LM90SB_2-ΔflaA对RAW264.7的黏附和侵袭数均显著低于野毒株LM90SB_2(P<0.05);LM90SB_2-ΔflaA与LM90SB_2的BF形成规律基本相同,但缺失株形成的BF总量显著低于野毒株的(P<0.05),且与野毒株相比,缺失株的BF结构中核酸与多糖的分布均松散、稀疏、散点状分布。本研究结果表明,flaA基因对LM90SB_2的细胞黏附和侵袭能力均有影响,在其BF形成过程中发挥着重要的作用。

空肠弯曲菌flaA基因序列及功能预测分析

[目的]对空肠弯曲菌空肠弯曲菌flaA基因的序列及功能进行预测分析。[方法]分析了多个空肠弯曲菌flaA核酸及氨基酸序列组成和序列差异性;预测分析了flaA基因密码子使用偏好性、蛋白结构和功能域、Fla A与相关功能蛋白的互作情况。[结果]不同菌株的flaA基因序列存在差异性,且差异主要存在于序列的中间区域。不同空肠弯曲菌菌株的同一基因在密码子选择上存在差异。Fla A与多个蛋白存在不同形式的相互作用。[结论]该研究可为空肠弯曲菌flaA基因序列分析和功能研究应用提供基础和依据。

嗜肺军团菌flaA基因的克隆及原核融合表达

目的构建嗜肺军团菌鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达,为进一步研究鞭毛亚单位蛋白的致病作用和免疫保护性提供前提条件。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌flaA基因,与带有硫氧还蛋白基因(Trx)的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-flaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌1435bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-flaA,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-flaA在大肠杆菌中得到了高效融合表达。结论成功构建嗜肺军团菌flaA基因重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达。

mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblotting进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达。结论嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础。

福建省食品中分离的空肠弯曲菌株鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型

目的:采用PCR-RFLP基因分型方法对分离自福建省不同地区不同种类食品中的空肠弯曲菌株的鞭毛蛋白基因flaA进行分型,掌握福建省食品中空肠弯曲菌的基因型别,为流行病学追踪调查提供科学依据。方法:采用欧洲弯曲菌实验室网络Campynet推荐的空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型方法(http://Campynet.vetinst.dk/Fla.htm)。即用PCR技术对弯曲菌的鞭毛蛋白基因flaA上的一个1700 bp片段进行扩增,再用限制性内切酶DdeI对PCR产物进行酶切,通过凝胶电泳并分析酶切图谱。结果:目前福建省食品中分离的空肠弯曲菌基因型别较多样,34株空肠弯曲菌可分为18个型别。不同地区分离的菌株其基因型多不相同,只有4个型别在不同地区的菌株间有重复。结论:空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型方法分辨率高,可重复性好,不需要特殊设备,且操作简单、快速,适合于实验室开展,且方法标准化后,能将世界各地获得的数据进行比较,从而能更好的了解各个基因型的区域分布和流行趋势。

益生菌发酵乳无菌提取物对空肠弯曲杆菌flaA σ^(28)启动子的抑制作用(英文)

为了研究益生菌发酵乳无菌提取物对食源性有害微生物(空肠弯曲杆菌)有毒基因表达的抑制作用,以利用空肠弯曲杆菌的有毒基因flaA σ28启动子和无启动子的质粒pRYluxCDABE联结构建的生物冷光转基因模型为试验材料,通过检测生物发光特性的方法,研究了空肠弯曲杆菌有毒基因flaA表达与益生菌(5种双岐杆菌,6种乳酸杆菌)发酵乳无菌提取物之间的关系。结果表明,益生菌发酵乳无菌提取物对空肠弯曲杆菌flaA σ28启动子的活性有显著的抑制作用(P<0.05),并可显著抑制空肠弯曲杆菌有害基因flaA的表达。

不同环境中嗜肺军团菌FlaA和CsrA基因表达水平初步研究

目的初步探讨多种环境介质中嗜肺军团菌FlaA和CsrA基因表达水平的差异。方法于2010年8月和9月随机选取南京市四家公共场所采集集中空调系统的冷却水、冷却塔旁土壤、风管内壁积尘和室内送风口气溶胶,喷泉水、喷泉旁土壤,宾馆淋浴水样品。采用实时荧光定量PCR方法检测环境样本中嗜肺军团菌FlaA和CsrA基因的表达水平。结果不同环境样本中嗜肺军团菌FlaA和CsrA基因均有表达,淋浴水中FlaA基因的相对表达量上调6.798 4倍,CsrA基因相对表达量上调1.483 7倍。结论不同环境介质中嗜肺军团菌FlaA和CsrA基因的表达水平有变化,FlaA基因的总体表达水平稍高于CsrA基因。

益生菌发酵乳无细胞提取物对空肠弯曲杆菌转基因模型中flaA致病基因σ^28启动子的抑制作用

以携带融合质粒pRY107luxCDABE的空肠弯曲杆菌转基因生物模型为检测材料,通过测量其发出的可计量光,研究10种益生菌(5种双歧杆菌菌株(Bifidobacterium strains)和5种乳酸杆菌菌株(Lactobacillus strains)发酵乳无细胞提取物对该模型中σ28启动子的影响。结果表明:益生菌发酵乳无细胞提取物均能显著抑制空肠弯曲杆菌Campylobacter jejuni(ATCC33291和ATCC35921)的生长,并能极显著抑制(P<0.01)空肠弯曲杆菌flaA致病基因σ28启动子的活性,从而抑制空肠弯曲杆菌有毒基因flaA的表达,而两种非益生菌乳酸链球菌和嗜热链球菌的抑制作用较小。

嗜肺军团菌mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体的构建及表达

目的选取嗜肺军团菌mip和flaA优势抗原表位基因,构建mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体,并在原核系统中表达,为后续制备嗜肺军团菌蛋白疫苗提供初步的实验基础。方法运用生物信息学方法对Mip和FlaA蛋白的二级结构和表面特性如理化性质、亲水性、可塑性、抗原指数以及胞外区等方面进行分析,选择其活性表位可能存在的区域为优势抗原表位区。通过PCR扩增和T4连接酶构建pET-mip、pET-flaA和pET-mip/flaA优势抗原表位基因融合表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。结果 Mip和FlaA都存在多个潜在的抗原表位位点,选取其优势抗原表位区域进行克隆和表达获得成功,并成功表达了mip/flaA二联优势抗原表位融合蛋白。结论 DNA Star软件和Expasy在线蛋白分析系统能够成功预测嗜肺军团菌Mip和FlaA抗原的表位;选取其优势抗原表位成功构建了pET-mip/flaA二联原核表达载体,并高效表达。

用PCR检测鸡的弯杆菌

埃及研究人员应用PCR而不需增菌培养检测鸡体内的弯杆菌。这种PCR用大肠杆菌VC167鞭毛蛋白flaA基因的一个靶区。来源于流行鸡场肉鸡的79份泄殖腔拭子提取的DNA在PCR上的450—bP区中得到扩增信号。在该测定中,用从9种肠道和6种非肠道微生物提取的DNA作为阴性对照,不能与探针杂交。将所有泄殖腔样品直接在弯杆菌血液琼脂平板上培养不能产生任何生长。