大肠杆菌Nissle 1917鞭毛蛋白FliC的结构特性及刺激Caco-2细胞作用的研究

试验旨在分析大肠杆菌Nissle 1917鞭毛蛋白FliC(FliC_(EcN))的结构特征及其对Caco-2细胞的刺激作用。试验通过大肠杆菌BL21(DE3)表达FliCEcN蛋白、经NTA柱纯化FliC_(EcN)蛋白并通过SDS-PAGE和Westernblot验证,利用SOPMA和Alphofold2预测FliC_(EcN)蛋白的结构模型、表面增强拉曼光谱和圆二色谱解析FliC_(EcN)蛋白的结构,使用FliC_(EcN)蛋白刺激Caco-2细胞后,检测免疫相关因子的分泌水平。结果显示,FliC_(EcN)蛋白的大小为64kDa,能够被抗His单克隆抗体特异识别;FliC_(EcN)蛋白的氨基和羧基末端主要由α-螺旋组成,中间结构域主要由β-折叠组成。FliC_(EcN)蛋白酰胺Ⅰ区最大吸收峰均位于1656 cm^(-1)处,主要二级结构为α-螺旋和β-折叠;FliC_(EcN)的α-螺旋占比44.4%,β-折叠占比23.4%,β-转角占比13.5%,无规则卷曲占比19.0%;FliC_(EcN)蛋白能够有效刺激Caco-2细胞分泌白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10);随着刺激时间延长,IL-6的分泌水平呈下降趋势,IL-10和TNF-α的分泌水平呈增加趋势。研究表明,α-螺旋和β-折叠是构成FliC_(EcN)的主要结构,可促进其构象的正确折叠和维持其三维结构稳定,FliC_(EcN)蛋白刺激Caco-2细胞分泌IL-6、IL-10、TNF-α的水平存在差异。

嗜肺军团菌flaA基因的克隆及原核融合表达

目的构建嗜肺军团菌鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达,为进一步研究鞭毛亚单位蛋白的致病作用和免疫保护性提供前提条件。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌flaA基因,与带有硫氧还蛋白基因(Trx)的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-flaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌1435bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-flaA,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-flaA在大肠杆菌中得到了高效融合表达。结论成功构建嗜肺军团菌flaA基因重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达。

mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblotting进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达。结论嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础。

哈维氏弧菌FlaA基因的克隆、序列分析及真核表达质粒的构建

哈维氏弧菌是水产病害中常见的致病菌.参照基因库上登录的弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因序列设计简并引物,PCR扩增哈维氏弧菌TS-628株的FlaA全基因,并克隆到pMD 18-T载体中测序,经序列分析该基因全长1 140 bp,编码379个氨基酸.与基因库中其他弧菌的同源基因序列比较显示,哈氏弧菌FlaA基因与霍乱弧菌FlaA基因的同源性最高(79.5%),该基因编码的多肽缺乏半胱氨酸,并在N-,C-两端的氨基酸序列较为保守,中间区域的变异较大.对该蛋白的氨基酸组成及空间结构进行了分析和预测,并推测该蛋白质的平均分子量为40.6 kDa.在该基因末端加上一段编码Flag短肽的核苷酸序列后克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得带哈氏弧菌鞭毛丝蛋白FlaA基因的真核表达重组质粒pcDNA-FlaA-tag,为其DNA疫苗的进一步研究奠定了基础.

嗜肺军团菌flaA基因DNA疫苗的构建及其免疫保护性研究

目的构建flaA基因的DNA疫苗,观察其对嗜肺军团菌感染的免疫保护作用。方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-flaA上切下flaA基因,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-flaA。将18只BALB/c雌性小鼠随机分为3组,pcDNA3.1-flaA实验组肌肉接种pcDNA3.1-flaA质粒100μg,2w后加强免疫一次,2个对照组分别肌肉注射等体积的生理盐水和100μg空质粒,加强免疫后3w小鼠鼻腔滴注嗜肺军团菌Lp1菌液进行攻击感染,感染4w后,检查小鼠肺组织带菌量,观察肺组织病理形态学改变。结果成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-flaA,攻击感染实验表明,pcDNA3.1-flaA免疫组肺组织带菌量显著少于生理盐水对照组和空质粒对照组(P<0.05),且肺组织病理变化症状较pcDNA3.1对照组和生理盐水对照组的肺轻微。结论由flaA基因构建的嗜肺军团菌DNA疫苗能诱导小鼠产生保护性免疫。

框镜鲤维氏气单胞菌CY0806株鞭毛flaA基因的克隆与生物信息学分析

以框镜鲤Cyprinus carpio维氏气单胞菌Aeromonas veronii CY0806株细菌基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得flaA基因,将其克隆并测序,测序结果与气单胞菌属的不同菌株进行相似性分析,并对flaA基因编码蛋白质进行生物信息学分析.结果显示:获得框镜鲤维氏气单胞菌鞭毛flaA基因,长915 bp,编码304个氨基酸,系统进化树分析,其与其他维氏气单胞菌flaA基因处于同一分支,相关生物信息学分析显示,flaA基因编码的蛋白质相对分子质量32 098.66,等电点5.57,半衰期30 h,不稳定系数为32.31,脂肪系数81.05,不存在信号肽和跨膜区,二级结构预测:flaA基因以α螺旋和β折叠为主,同时,以同源建模法预测了flaA基因编码蛋白的三维立体结构.

维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA的克隆及原核表达

本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性。根据GenBank公布的序列设计1对引物,经PCR扩增获得flaA基因的完整开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-30a,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化。SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌成功表达,约在38ku处可见清晰的表达产物,诱导产物大小与理论值相符。经Western blotting检测,结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体和His-tag抗体发生免疫反应。因此,本试验成功表达了维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA,为进一步研究其生物学功能及免疫佐剂作用奠定了基础。

副溶血弧菌融合蛋白FlaA-OmpK疫苗的制备及免疫保护作用

采用延伸PCR技术拼接副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus VpATCC17802)的外膜蛋白K基因ompK和鞭毛蛋白A基因flaA,获得融合基因flaA-ompK。制备高纯度的r-OmpK,r-FlaA及r-FlaA-OmpK蛋白。分别以所制备的OmpK、FlaA-OmpK和混合蛋白OmpK+FlaA作为免疫原,通过口服及注射的方法免疫黑石斑鱼(Centropristisstriata),研究其免疫原性及对野生副溶血弧菌(Vp89)感染的免疫保护作用。ELISA分析结果表明,注射FlaA-OmpK组抗体效价最高,是OmpK组的2倍,是混合蛋白组的4倍,注射FlaA-Ompk提供的免疫保护率达到80%。本工作制备了FlaA-Ompk肠溶口服微球疫苗,口服免疫组血清抗体效价低于注射组血清抗体效价,口服FlaA-Ompk提供的免疫保护率达到50%。研究结果显示融合蛋白FlaA-Ompk具有良好的免疫原性,可作为多元弧菌疫苗抗原成份。

福建省食品中分离的空肠弯曲菌株鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型

目的:采用PCR-RFLP基因分型方法对分离自福建省不同地区不同种类食品中的空肠弯曲菌株的鞭毛蛋白基因flaA进行分型,掌握福建省食品中空肠弯曲菌的基因型别,为流行病学追踪调查提供科学依据。方法:采用欧洲弯曲菌实验室网络Campynet推荐的空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型方法(http://Campynet.vetinst.dk/Fla.htm)。即用PCR技术对弯曲菌的鞭毛蛋白基因flaA上的一个1700 bp片段进行扩增,再用限制性内切酶DdeI对PCR产物进行酶切,通过凝胶电泳并分析酶切图谱。结果:目前福建省食品中分离的空肠弯曲菌基因型别较多样,34株空肠弯曲菌可分为18个型别。不同地区分离的菌株其基因型多不相同,只有4个型别在不同地区的菌株间有重复。结论:空肠弯曲菌鞭毛蛋白基因flaA的PCR-RFLP分型方法分辨率高,可重复性好,不需要特殊设备,且操作简单、快速,适合于实验室开展,且方法标准化后,能将世界各地获得的数据进行比较,从而能更好的了解各个基因型的区域分布和流行趋势。

绵羊脑炎单核增生性李斯特菌LM90 SB_2鞭毛基因FlaA的敲除及对毒力影响的研究

目的研究缺失了flaA基因编码的鞭毛蛋白对LM90 SB_2的毒力等方面的影响。方法应用同源重组技术构建LM90 SB_2的flaA基因突变株,通过生长曲线的测定、运动性试验、BF形成能力以及LD_(50)的测定来探究缺失flaA基因后对LM90 SB_2毒力的影响。结果与野毒株相比突变株菌落形态未发生改变,仍具有良好的遗传稳定性,但生长变缓,在25℃的环境中运动性显著降低,突变株BF形态结构更加松散和不完整;野毒株和突变株的小鼠LD_(50)的菌量分别为4.27×10~6cfu和1.62×10~7 cfu。结论 flaA基因可以影响LM90 SB_2的鞭毛的形成,缺失flaA基因后LM90 SB_2形成BF能力以及菌株的毒力显著下降。

益生菌发酵乳无菌提取物对空肠弯曲杆菌flaA σ^(28)启动子的抑制作用(英文)

为了研究益生菌发酵乳无菌提取物对食源性有害微生物(空肠弯曲杆菌)有毒基因表达的抑制作用,以利用空肠弯曲杆菌的有毒基因flaA σ28启动子和无启动子的质粒pRYluxCDABE联结构建的生物冷光转基因模型为试验材料,通过检测生物发光特性的方法,研究了空肠弯曲杆菌有毒基因flaA表达与益生菌(5种双岐杆菌,6种乳酸杆菌)发酵乳无菌提取物之间的关系。结果表明,益生菌发酵乳无菌提取物对空肠弯曲杆菌flaA σ28启动子的活性有显著的抑制作用(P<0.05),并可显著抑制空肠弯曲杆菌有害基因flaA的表达。

幽门螺杆菌flaA基因表达载体的构建和产物免疫性的鉴定

采用高保真PCR从幽门螺杆菌Y0 6株DNA中扩增全长flaA基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 pET32a的flaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用Hp全菌抗体的westernblot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。所克隆的flaA基因核苷酸和氨基酸序列与文献报道的同源性分别为 96 .2 8%～ 97.13%和 99.4 1%～ 10 0 %。pET32a flaA BL2 1DE3系统表达的FlaA融合蛋白量高达细菌总蛋白的 4 0 %～ 5 0 %。FlaA融合蛋白能与Hp全菌抗体及家兔免疫血清发生结合反应。

AEG-1肺归巢域与Flagellin融合基因的杆状病毒制备及鉴定

目的通过重叠PCR方法获得AEG-1C-Flic融合基因,采用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统获得重组AEG-1C-Flic杆状病毒,为后续AEG-1C-Flic病毒样颗粒疫苗的制备奠定基础。方法从鼠伤寒沙门菌的基因组中PCR扩增细菌鞭毛蛋白Flagellin,采用重叠PCR的方法将AEG1肺归巢域段基因与Flagellin融合,并添加猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)包膜蛋白gp41信号肽与跨膜区,构建AEG-1C-Flic pFastBacTM重组表达载体,转座大肠杆菌E.coliDH10Bac感受态细胞后获得重组杆粒,重组杆粒转染昆虫细胞Tn5,获得AEG-1CFlic重组杆状病毒,并采用Western Blot方法对该病毒进行鉴定。结果构建的AEG-1C-Flic杆状病毒表达载体经双酶切及测序正确,通过转化E.coli DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,经PCR鉴定大小正确,Western Blot结果显示Bacmid转染Tn5细胞后成功获得重组杆状病毒rBv AEG-1C-Flic。结论成功构建的AEG-1C-Flic杆状病毒可用于新型AEG1-病毒样颗粒疫苗的制备。

转燕麦噬酸菌蛋白激发子基因flagellin的链霉工程菌株构建及鉴定

利迪链霉菌A01可以产生大量的抗生素——纳他霉素,其通过结合病原真菌细胞膜上的甾醇分子而起到抑制病原菌生长的作用。燕麦噬酸菌的鞭毛蛋白组分FLAGELLIN可以诱导植物抗性,激发活性氧及水杨酸防御反应途径。本研究将燕麦噬酸菌蛋白激发子基因flagellin克隆,接合转移入利迪链霉菌A01中,使工程菌增加诱导植物抗性的功能。PCR验证表明:成功获得了含flagellin基因的阳性工程菌株,证明通过链霉工程菌构建可实现抗生与诱抗的协同作用,预计会提高防治植物病害的效果。

幽门螺杆菌flaA基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的 :观察幽门螺杆菌 (H .pylori )flaA基因在大肠杆菌中的表达。方法 :用PCR方法扩增flaA基因 ,然后插入原核表达载体pMAL c2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果 :特异PCR和酶切鉴定证实flaA基因克隆入表达载体 ,并以融合蛋白形式MBP FLA高效表达 ,约占细胞总蛋白的 2 8%。该融合蛋白可与H .pylori阳性病人血清和小鼠H .pylori全菌抗体发生特异反应。结论 :成功构建了能高效表达H .pyloriFlaA蛋白的重组质粒 ,为H .pylori多价基因工程疫苗的研制奠定了基础。

猪支气管败血波氏杆菌FlaA基因克隆与序列分析

参考相关资料，针对支气管败血波氏杆菌Bordetella bronchiseptica FlaA基因上游序列选择合成1对特异性引物，对贵州分离株（B8株和B27株）进行PCR扩增，将扩增产物连接在pMD18-T载体上，并转化到DI-L5a感受态细胞中，提取重组质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序。结果获得分子长为237bp的特异性DNA片段；核苷酸同源性分析表明，贵州分离株间的同源性高达99．1％，与Bb参考株的同源性为97．8％～99．6％，与Bpp参考株的同源性为95．6％-97．4％；系统进化树分析表明，贵州分离株与Bb参考株亲缘关系较近，而与Bpp参考株亲缘关系远。

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)鞭毛蛋白FlaA的重组表达与多克隆抗体制备

副溶血性弧菌是广泛存在于水产品中的革兰阴性致病菌。鞭毛蛋白FlaA是副溶血性弧菌的一种特异性的蛋白质,以该蛋白质作为抗原所制备到的抗体可以作为检测副溶血性弧菌的探针。该研究通过分子生物学方法构建了重组FlaA的表达载体pET28a-flaA,并采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导实现FlaA的大量表达。该重组蛋白以可溶性形式存在,经Ni-NTA亲和柱纯化后对家兔进行免疫,得到浓度为24.32 mg/mL、效价为1∶125,000的抗FlaA抗体。通过间接ELISA实验,测得该抗体与副溶血性弧菌反应的灵敏度为1.0×104CFU/mL,且该抗体与5种其他常见致病菌无明显交叉反应。

在线离子交换预富集–FLAAS测定环境水样中的铬(Ⅵ)

采用在线离子交换预富集–火焰原子吸收光谱法(FLAAS)测定环境水样中痕量铬(Ⅵ)。通过试验考察样品溶液pH、洗脱剂浓度、离子交换树脂用量及共存离子对离子交换树脂富集效果的影响。结果表明,当交换树脂用量为0.50 g,样品溶液pH值为6.0时,用0.60 mol/L盐酸–10%抗坏血酸进行洗脱具有良好效果。铬(Ⅵ)的质量浓度在0～20.0μg/L之间与吸光度呈良好的线性关系,线性相关系数大于0.9998。该方法用于在线分离和富集环境水样中的铬(Ⅵ),灵敏度提高了100倍,加标回收率为96%～104%。

激动剂Flagellin对中性粒细胞凋亡和Bax蛋白表达的影响

目的:研究TLR激动剂flagellin影响中性粒细胞凋亡及凋亡调控蛋白Bax的表达。方法:分离培养正常人的外周血中性粒细胞,分为实验组(flagellin刺激组)、凋亡抑制组(LPS刺激组)和自然凋亡组。用流式细胞术检测不同组中性粒细胞的凋亡发生率,通过Western blotting技术检测各组中性粒细胞Bax蛋白的表达。结果:flagellin使中性粒细胞自发性凋亡的发生率增高,与凋亡抑制组和自然凋亡组比较差异有统计学意义(P<0.01);接受flagellin刺激的中性粒细胞表达Bax蛋白高于凋亡抑制组与自然凋亡组(P<0.01)。结论:在TLR激动剂诱发的中性粒细胞生存效应中,flagellin可能通过上调中性粒细胞胞内Bax蛋白的表达来缩短中性粒细胞的生命期限。

flaA基因的缺失对绵羊脑炎单核细胞增生李斯特菌的细胞黏附、侵袭能力及生物被膜形成能力影响的研究

为了探究flaA基因对单核细胞增生李斯特菌LM90SB_2黏附和侵袭MBMEC、RAW264.7能力、生物被膜(BF)形成能力的影响,本研究分别进行了flaA基因缺失株LM90SB_2-ΔflaA与野毒株LM90SB2对细胞黏附和侵袭试验,定性定量分析了他们生物被膜形成能力以及小鼠不同脏器中载菌量差异。结果显示:LM90SB_2-ΔflaA对MBMEC的黏附菌数较野毒株LM90SB_2低,且两者差异性显著(P<0.05),两者对MBMEC的侵袭数差异性不显著(P>0.05),而LM90SB_2-ΔflaA对RAW264.7的黏附和侵袭数均显著低于野毒株LM90SB_2(P<0.05);LM90SB_2-ΔflaA与LM90SB_2的BF形成规律基本相同,但缺失株形成的BF总量显著低于野毒株的(P<0.05),且与野毒株相比,缺失株的BF结构中核酸与多糖的分布均松散、稀疏、散点状分布。本研究结果表明,flaA基因对LM90SB_2的细胞黏附和侵袭能力均有影响,在其BF形成过程中发挥着重要的作用。