Duddingtonia flagrans几丁质酶CTS3/CTS4的分子特征及亲缘关系

【目的】探究捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans几丁质酶的生物学特性与亲缘关系。【方法】对捕食线虫性真菌D.flagrans几丁质酶CTS3和CTS4基因进行克隆和测序,并对其编码蛋白的信号肽、亲/疏水性、催化结构域、保守序列、二级与三级结构等分子特征进行预测以及其他真菌几丁质酶的亲缘关系进行分析。【结果】几丁质酶CTS3和CTS4含有几丁质酶催化结构域的2个高度保守序列(SIGG和DGFDLDXE)及1个典型的(α/β)8桶状结构域,属于糖苷水解酶18家族(GH18)。CTS3和CTS4几丁质酶均为分泌型蛋白,在N端的第1~25和1~18个氨基酸分别为其信号肽序列,C端均含有糖苷水解酶18家族结构域。分子结构分析表明,几丁质酶CTS3和CTS4三级结构具有(α/β)8的TIM桶形结构,中心部分为平行的β⁃折叠组成的内桶,外桶由α1~α8组成;底物结合区域位于保守序列β3和β4链形成的环状裂隙。亲缘关系分析表明,CTS3和CTS4与昆虫致病真菌几丁质酶同源性较高,它们聚为一支,推测在侵染宿主的过程中具有相似的生物学功能。【结论】2个几丁质酶基因分子特征与亲缘关系的阐明,为研发新型家畜消化道线虫病生防制剂奠定了基础。

嗜线虫真菌中Duddingtonia flagrans培养性状的初步研究

研究嗜线虫真菌中 Duddingtonia flagrans在不同生长环境中的培养特性。选择普通琼脂培养基 ( WA)、玉米琼脂培养基 ( CMA)、马铃薯琼脂培养基 ( PA)和面粉琼脂培养基 ( FA) 4种不同培养基培养 ,结果表明 ,在 WA中真菌生长速度最快 ,在 PA中产孢量最多。从应用的角度考虑 ,PA为最佳培养基 ;以 10～ 35℃每隔 5℃设置 7种不同温度组培养 ,结果表明 ,10℃和 35℃时不生长 ,2 5℃和 30℃时菌丝生长率较高 ,产孢量较多 ,其中以

食线虫真菌Duddingtonia flagrans海藻酸钠包埋颗粒不同保存条件下杀虫效果研究

为了解食线虫真菌Duddingtonia flagrans海藻酸钠包埋颗粒中厚垣孢子在贮存期间的稳定性,本研究将含有D.flagrans的颗粒(实验组)和不含有D.flagrans的颗粒(对照组)分别置于4℃、-20℃各保存2年、4年以及完全暴露在户外0~12个月,用含有捻转血矛线虫虫卵的绵羊粪便与颗粒制剂进行体外试验,测定感染性幼虫(L3)的数量。另取4℃和-20℃同期保存的D.flagrans颗粒制剂,每批喂服绵羊2只(共24只),进行体内试验,测定喂服前后绵羊粪便中L3的数量。结果显示,颗粒制剂于4℃和-20℃保存2年、4年时,体外试验中实验组粪便L3数量均显著低于对照组(p<0.05),对L3的杀虫率为66.32%~94.01%;颗粒制剂通过绵羊消化道后对粪便L3杀虫率均在60%以上。该制剂在完全户外条件下存放0~12个月,杀虫率从88.88%降至57.84%。上述结果表明D.flagrans颗粒在低温贮存时有效期可达4年,在完全户外贮存时有效期至少可达半年。本研究结果为海藻酸钠颗粒制剂大规模应用奠定基础。

食线虫真菌Duddingtonia flagrans冻干制剂低温保存后体外杀虫效果研究

测定食线虫真菌Duddingtonia flagrans冻干制剂在4℃贮存2年期间对绵羊捻转血矛线虫感染性幼虫(L3)杀虫活性的变化。用食线虫真菌D.flagrans当地分离株(SDH035)进行厚垣孢子培养,经真空冷冻干燥后制备成冻干制剂。三批冻干制剂分别在4℃保存1年和2年时取样,加入含有捻转血矛线虫虫卵的绵羊粪便为试验组,对照组的粪便不加真菌,然后进行粪便培养、L3分离和计数,计算L3的平均数和百分减少率。

食线虫性真菌Duddingtonia flagrans F088的生长和产孢特性

【目的】研究食线虫性真菌Duddingtonia flagrans生长特性和不同营养要素对产孢量的影响,为其规模化发酵工艺的确定提供参考。【方法】以D.flagrans F088分离株为研究对象,研究该菌培养过程中pH值、厚垣孢子产量、菌丝干质量等指标的变化;通过单因素试验及正交试验,研究几种常见碳源、氮源、无机盐、维生素和碳氮比对厚垣孢子产量和菌丝平均生长速率的影响。【结果】供试真菌在培养2 d后进入对数生长期,4 d时达到高峰(OD600值为7.46,菌丝干质量为12.07 g/L),而pH快速下降至4.45;3 d开始产生厚垣孢子,4 d时呈爆发式增长。OD600与菌丝干质量、厚垣孢子产量呈极显著正相关,与pH呈极显著负相关。单因素试验结果表明,产生厚垣孢子的最佳碳源为白糖,氮源为大豆蛋白胨,碳氮比为40∶1,维生素为VB1、无机盐为MgSO4;菌丝生长较好的碳源为红糖,氮源为大豆蛋白胨,与对照相比,无机盐和维生素对菌丝生长无显著促进作用。4因素3水平正交试验结果显示,D.flagrans F088产生厚垣孢子和菌丝生长的最佳配方组合为:30 g/L白糖、4 g/L大豆蛋白胨、1 g/L MgSO4和30 mg/L VB1。【结论】初步明确了D.flagrans F088培养过程中pH、厚垣孢子产量、菌丝干质量等的变化趋势,确定了该菌菌丝平均生长速率和厚垣孢子产量达到最佳时的营养要素和配方组成。

相对湿度和培养时间对食线虫真菌Duddingtonia flagrans产孢量的影响

本研究旨在评估食线虫真菌Duddingtonia flagrans当地分离株(SDH035)在生长发育的过程中培养时间和环境中的相对湿度对其产孢量的影响。利用实验室已保存的当地分离的SDH035分离株,用液固双相法分别在35%和85%的相对湿度下分别培养7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和62 d,用0.05%(w)的灭菌Twain-80将生长在谷粒表面的菌物洗脱下来,用双层纱布过滤,获得含有厚垣孢子的菌悬液,用血细胞计数版对其孢子进行计数,最后推算出每克谷粒产生的厚垣孢子数量。结果表明,随着培养时间的延长,该菌株的产孢量逐渐升高,当培养时间为7~14 d时,产孢量缓慢上升,此后产孢量急速增加,在培养28 d后该菌株的产孢量趋于平缓,培养至49 d时其产孢量达到高峰。分离株在两种相对湿度、不同培养时间段的产孢量。在相同的培养时间下,85%的相对湿度所获得的产孢量显著高于35%的相对湿度。培养时间和湿度条件均影响厚垣孢子的产量。

Duddingtonia flagrans冻干制剂厚壁孢子优化培养及其杀线虫幼虫剂量研究

【目的】探究捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans冻干制剂厚壁孢子的批量培养方法及其对线虫幼虫的毒杀剂量。【方法】通过玉米粒或大麦粒培养基的单步培养法,以及先在含有0.05%琼脂粉的沙氏葡萄糖肉汤培养基中培养7d后继而转接到玉米粒或大麦粒培养基的双步培养法,以培养3~5周后洗脱的每克固体培养基中的厚壁孢子数为依据,对D.flagrans的最优培养方法进行筛选;然后使用最优培养法培养D.flagrans厚壁孢子并将其冻干后用于体外杀线虫幼虫试验,研究D.flagrans冻干制剂的杀线虫幼虫剂量。【结果】培养基质不同时,D.flagrans的菌落颜色有一定差异,玉米粒培养基中的菌落颜色呈微黄色,而大麦粒培养基中的菌落呈白色;D.flagrans的适宜培养时间为3周。采用单步培养法时,玉米粒培养基培养的厚壁孢子数量为2.4×10~5个/g,大麦粒培养基培养的厚壁孢子数量为3.2×10~5个/g;而采用双步培养法时,玉米粒培养基培养的厚壁孢子数量为3.0×10~5个/g,大麦粒培养基培养的厚壁孢子数量为3.5×10~5个/g。D.flagrans冻干制剂杀线虫幼虫剂量的阈值为每克粪便4×10~5个D.flagrans厚壁孢子,相应对线虫幼虫的杀虫率为95.2%。【结论】采用双步培养法培养厚壁孢子并将其制备成冻干制剂,在D.flagrans生物防治寄生性线虫病方面有较好的应用前景。

捕食性真菌与植物单宁联合制剂对绵羊消化道线虫的杀灭效果

为了测试捕食线虫性真菌(Duddingtonia flagrans)及植物单宁对绵羊消化道线虫的杀灭效果,在制备伊维菌素、捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans及植物单宁片剂与联合制剂的基础上,进行了绵羊消化道线虫的防控试验,并通过EPG的计数评测驱虫效果。结果表明,成功制备了生物制剂与药物的联合制剂,动物试验表明该制剂具有一定杀虫效果。试验发现单宁酸有一定驱线虫作用;植物单宁、驱虫药与捕食性真菌联合制剂的防治效果优于单一组分组。试验结果为绵羊消化道线虫防治提供了新方法,为植物源杀虫活性物质研究提供了参考数据。

捕食性真菌Duddingtonia flagrans胞外蛋白质的生化性质研究

为纯化捕食性真菌Duddingtonia flagrans分泌的胞外蛋白酶并研究其生化性质,利用枸橼酸液体培养基对D.flagrans进行培养,以灭菌的马圆线虫进行诱导,之后用盐析法粗提培养液,再使用Sephadex G-100分子筛进行层析纯化,最后对纯化物进行最适pH、温度及蛋白酶抑制剂的抑制试验。结果显示,被纯化出的3种胞外蛋白酶的分子质量分别为38、63、19ku;在pH 6.0~7.0、45~55℃条件下,其活性最高;它们都对酶抑制剂菲罗啉和抑肽素非常敏感,其中38ku的蛋白酶对抑制剂PMSF也很敏感。上述结果为进一步研究捕食性真菌分泌的胞外蛋白酶在杀线虫过程中的作用以及今后在生产中的具体应用提供了重要参考依据。

捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans胞外蛋白质的产生及其杀虫作用的研究

将捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans接入含有不同诱导物的LMZ培养基和枸橼酸液体培养基中,然后进行为期6d的培养并收集发酵液,进而测定其中蛋白质的质量浓度和蛋白酶活性及磷酸酶活性,并用发酵液进行杀虫试验。结果显示,动物寄生性线虫诱导的枸橼酸培养基发酵液中蛋白质的质量浓度最高可达381.4mg/mL,蛋白酶和磷酸酶比活性最高,分别为9.48U/mL±0.03U/mL和38.30U/L±0.04U/L,对线虫的致死率为50.11%±11.8%,均明显高于相应的对照组;同时发现,D.flagrans发酵液对蝇蛆的致死率最高,可达40.56%±0.13%。结果表明,在D.flagrans发酵液中含有杀虫物质。研究结果为以后研究捕食线虫性真菌的化学杀虫机理提供了重要依据。

不同培养基及诱导物对捕食性真菌Duddingtonia flagrans发酵液中蛋白质的产生及杀虫作用的影响

为研究捕食性真菌Duddingtonia flagrans发酵液中蛋白质的产生及杀虫作用,使用不同营养成分组成的液体培养基及诱导物,对Duddingtonia flagrans进行培养和诱导,测定其发酵液中的蛋白质含量、蛋白酶活性、磷酸酶活性和杀虫作用,进而确定Duddingtonia flagrans产生胞外蛋白质和杀虫作用最适的培养基与诱导物。结果显示,不同培养基及诱导物对Duddingtonia flagrans的代谢过程会产生明显影响,导致其分泌的蛋白质种类、浓度以及蛋白酶和磷酸酶的活性显著不同;Duddingtonia flagrans发酵液不仅具有杀线虫活性,而且有杀蝇蛆作用。上述结果为进一步研究捕食线虫性真菌的杀虫机理提供了重要参考依据。

不同培养条件对捕食性真菌Duddingtonia flagrans生长的影响

为了研究不同生长条件对捕食线虫性真菌Duddingtoniaflagrans生长的影响,本研究将带有D.flagrans菌丝的琼脂块分别接种于不同碳氮比及不同pH值(4.0~8.5)的CMA固体培养基中,在不同温度下(10℃~45℃)进行培养,每天定时观察菌株的发育情况,并测量菌丝生长长度。结果表明,D.flagrans生长最适pH值范围为6.5~7.0,其中以pH 7.0中生长最快;最适温度为35℃;最适碳氮比范围为5∶1~10∶1,其中在碳氮比为5∶1时,生长率最高。菌丝呈辐射状生长,纵横交错,无色,分隔,生长后期有缠绕圈和厚壁孢子的形成。上述结果为进一步研究D.flagrans的生长特性及捕食作用条件奠定了基础。

捕食性真菌Duddingtonia flagrans原生质体的快速制备与再生

为快速获得大量捕食性真菌Duddingtonia flagrans原生质体并使其再生,本试验研究了酶质量浓度、酶解温度、菌龄、酶解时间对D.flagrans原生质体产生的影响,以确定D.flagrans原生质体最佳快速制备条件。结果表明,在溶壁酶2mL/L、蜗牛酶8g/L、纤维素酶8g/L时,35℃恒温条件下,酶解菌龄为2d的菌丝7h,捕食性真菌D.flagrans产生原生质体数量最多且能够再生。这为下一步转化并标记和克隆捕食性相关基因奠定了重要基础。

捕食性真菌Duddingtonia flagrans基因组DNA的提取及基因组survey分析

采用透析膜培养法结合DNA柱式提取法进行基因组DNA提取,同时利用第2代高通量测序技术,分析了捕食性真菌Duddingtonia flagrans基因组概况。结果显示:透析膜培养结合DNA柱式提取法所提取的基因组DNA质量及浓度均能达到测序标准;捕食性真菌Duddingtonia flagrans基因组约为37.6 Mb,GC含量为44.95%,基因组杂合度较低。结果表明:透析膜培养法结合柱式法提取其基因组DNA的方法简便可行,为丝状真菌DNA提取,提供了新的思路;基因组survey分析为捕食性真菌Duddingtonia flagrans全基因组精细图谱的绘制奠定了基础。

捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans冻干制剂临床模式

本试验选用耐高温高压的菌种袋作为玉米粒培养基的培养容器,对Duddingtonia flagrans厚壁孢子进行批量培养,然后经孢子洗脱液将孢子洗脱后,将其制备成冻干制剂,并在内蒙古地区的呼和浩特市和林格尔、包头市萨拉齐、呼伦贝尔西旗等地养殖场共165头绵羊中进行了临床应用研究。通过设立不同的试验组和对照组,使用常用驱虫药伊维菌素进行驱虫试验,同时配合口服捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans厚壁孢子,在不同时间进行动物直肠采粪,对粪便进行第三期幼虫培养,然后检测比较不同组别粪便中感染性幼虫的数量,评价捕食线虫性真菌临床应用模式效果。结果显示,将伊维菌素与D.flagrans冻干制剂联合应用于绵羊的寄生性线虫病防治,可使粪便中幼虫数量降低100%,效果优于单独用药组。结果表明,捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans冻干生物制剂与驱虫药物联合使用的临床应用模式,可以取得较好的家畜线虫病临床防控效果,值得进一步在生产实践中进行深入研究和推广。

捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans冻干制剂的杀虫效果

本试验通过在含有0.05%琼脂粉的沙氏葡萄糖肉汤培养基中培养Duddingtonia flagrans(D.flagrans)再转接到玉米粒培养基的方法,对D.flagrans厚壁孢子进行培养,之后将其洗脱并制备成冻干制剂,然后对冻干制剂的萌发率和杀虫率进行观察。结果显示,D.flagrans冻干制剂厚壁孢子在接种玉米粉琼脂培养基(CMA)培养后5d萌发率达到峰值78.3%;经口饲喂绵羊D.flagrans冻干厚壁孢子剂量为1×106个/kg时,幼虫平均减少率为81.4%。结果表明,D.flagrans冻干制剂使用方便,复苏和杀虫效果较好,其在生物防制家畜胃肠道线虫病方面有很大的应用前景。

捕食性真菌Duddingtonia flagrans线虫诱导发酵液的蛋白质组学分析

捕食性真菌Duddingtonia flagrans杀虫机理是近年来生物防制领域的热点，而对其发酵液中的蛋白质组进行深入分析和研究．有利于揭示D．flagrans杀线虫的生化机制。本研究首次采用基于液质联用的蛋白质组学非标记定量（1abelfree）技术，对线虫幼虫诱导下的D．flagrans发酵液与普通营养菌丝发酵液进行了大规模蛋白质表达相对定量分析。结果，共鉴定出蛋白质258个，其中46个为显著差异表达蛋白质。进一步对差异蛋白质进行GO注释，结果表明，经线虫幼虫诱导的D．flagrans发酵液中差异蛋白参与的蛋白功能和生物学过程更加多样。以催化和结合功能为主，同时还参与感知环境刺激、信号转导、过氧化活性及胞壁合成等过程。进一步分析表明，与对照组相比，过氧化氢酶和三羧酸循环中柠檬酸甲酯合酶前体上调表达加快了有氧呼吸，推测D．flagrans分泌胞外蛋白酶还需要氧化应激。此外，丝氨酸酶与酪氨酸酶前体显著差异表达．可能该类酶是D．flagrans侵染线虫的重要毒力因子。KEGG代谢通路分析表明，差异蛋白还主要参与了糖、脂质和氨基酸等初级产物以及次级代谢物的合成与代谢过程。通过对差异蛋白质组的深入解析和研究，有利于揭示D．flagrans对线虫的作用机理，为应用D．flagrans对线虫生物防控提供了强有力的支撑。

用嗜线虫真菌防治家畜胃肠道线虫病的研究进展

简要论述了嗜线虫真菌种类及其捕捉器官和国内外生物防治家畜胃肠道线虫病的研究进展。国内外防治该病主要是用各种驱虫药物定期驱虫,由此造成寄生虫抗药性、动物组织残留药物、环境污染、线虫反复感染等诸多负作用。用线虫天敌嗜线虫真菌生物防治家畜胃肠道线虫病成为该领域研究的重点课题之一。实验室和野外的大量研究结果证明,嗜线虫真菌在通过动物胃肠道时能不被消化,从而保持活性,在粪便中能有效捕食营自由生活阶段的线虫幼虫,使放牧草场中感染性线虫幼虫明显减少,呈现出良好的生物防治效果。文章重点介绍了嗜线虫真菌Duddingtonia flagrans,对用嗜线虫真菌生物防治家畜胃肠道线虫病的前景充满信心。

真空冷冻干燥对食线虫真菌谷粒培养物含水量的影响

本研究旨在评估食线虫真菌Duddingtonia flagrans当地分离株(SDH035)在培养25 d后,经真空冷冻干燥后获得其谷粒培养物的水分含量水平。利用实验室已保存的当地分离的SDH035分离株,先用2%液体培养基中进行发酵培养,180 r/min,28℃培养7 d后终止培养。然后采用玉米和小麦谷粒联合培养基,进行厚垣孢子培养。终止培养后,测定谷粒培养物初始的水分含量,然后在-20℃条件下进行预冻处理12 h,最后置于真空冷冻干燥箱(冷阱温度为-55℃)中分别冷冻干燥3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h,在对其分别进行称重并计算水分含量。试验结果表明,上述谷粒培养物经真空冷冻干燥后,其含水量分别为48.26%、41.26%、38.16%、35.18%、30.49%、25.49%、21.06%和18.26%。