肝素黄杆菌发酵产肝素酶的工艺优化

以肝素黄杆菌为研究对象,提出了一种将发酵分为生长和产酶两个阶段的生产肝素酶的新工艺。对培养基组成进行了优化,优化后组成(g/L)葡萄糖8,氯化铵4,磷酸二氢盐6,组氨酸0.75,甲硫氨酸0.75,氯化镁0.5;微量盐10-4mol/L。菌体生长和产酶两个阶段的最优温度为27°C和23°C,pH为6.4和7.0。在诱导时加入10-4mol/LBa2+可以较好地消除SO2-4的阻遏作用。采用优化工艺,摇瓶产酶比原来提高了66%。

肝素黄杆菌菌种保存方法的研究

目的研究多种糖类对肝素黄杆菌细胞的保护作用及保藏菌种的方法。方法将多种糖类加入黄杆菌悬液,观察冷冻、冷藏、冷冻干燥过程中肝素黄杆菌的存活率,并将海藻糖和甘露醇添加进斜面固体培养基,观察菌种的有效保藏时间。结果糖类的加入明显提高了肝素黄杆菌菌种保存的存活率,其中以海藻糖和甘露醇效果最佳。结论在培养基中添加2%海藻糖或2%甘露醇可使菌株斜面冷藏保存时间延长2周。

添加核苷对肝素黄杆菌发酵产肝素酶的影响

研究了添加核苷对肝素黄杆菌发酵产肝素酶的影响,结果发现,单种核苷的添加会抑制产酶,而复合核苷的添加则促进产酶,当4种核苷的添加比例与肝素酶mRNA中4种相应核苷酸的比例一致时,促进作用最强。通过HPLC检测,证实添加后核苷很快进入了菌体内。HPLC的结果还表明,菌体内嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的合成代谢可能不平衡,这对产酶是不利的。为此,还研究了通过添加天冬氨酸以增强嘧啶核酸合成代谢的调节方式,使产酶得到了提高。

重组谷胱甘肽-S-转移酶-肝素酶Ⅰ在大肠杆菌中的表达、纯化及其性质

肝素酶Ⅰ(HeparinaseⅠ,HepⅠ)是一种多糖裂解酶,可特异性裂解硫酸肝素分子中糖苷键以制备低分子质量肝素(LMWH)。由于重组肝素酶Ⅰ在大肠杆菌中表达时极易形成包涵体,将肝素酶Ⅰ基因的N端融合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签,在大肠杆菌中进行低温表达。结果显示,约90%的GST-HepⅠ融合蛋白以可溶性形式表达,表达的目标蛋白粗酶经过一步亲和纯化,比活为124.7 U/mg,纯化倍数达到366.7倍,酶活回收率为31.0%;结果表明Ca2+对重组GST-HepⅠ有很强的激活作用,GPC-HPLC结果显示重组GST-HepⅠ与天然肝素酶Ⅰ裂解图谱相同。

肝素酶的发酵工艺研究

优化了发酵培养肝素黄杆菌生产肝素酶的半合成培养基配方,种子液种龄48h,接种量10%,装量90ml/(750ml摇瓶),25℃培养32h。采用该优化方案,肝素酶的发酵水平可达1768u/L,较合成发酵培养基提高52%。

重组黄杆菌肝素酶测活性方法的改进及影响因素的研究

目的提高Azure A法测活重组肝素酶的效率。方法通过缩短测定反应时间,提高酶活测定的效率。采用改进后的测活方法研究了温度、pH、盐离子浓度、不同金属离子对测活体系的影响。结果改进后的方法使肝素酶的测活效率提高了4倍,新的酶活测定方法最适反应条件为30℃,pH 7.0,盐离子浓度250 mmol/L。Cu2+对酶有轻微的激活作用,Pb2+、Mn2+则有较强的抑制作用。结论改进后的测活方法重复性好,测活效率大大提高。

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达。[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a(+)上构建表达载体,重组质粒转化E.coil BL21(DE3)进行蛋白质表达。[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a(+)载体上,重组质粒转入E.coil BL21(DE3)后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白。[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础。

肝素黄杆菌的明胶固定化

研究以明胶为载体、戊二醛作为交联剂制备固定化肝素黄杆菌的方法,并考察其固定化条件和酶学性质。论文对肝素黄杆菌细胞进行了缺壁处理,通过对明胶浓度、戊二醛浓度等条件的筛选和研究,确定了制备固定化肝素黄杆菌的最佳条件。此外,还对固定化细胞的酶学性质进行了初步研究,考察了温度、pH等因子对固定化细胞的影响。结果表明:明胶浓度15%、戊二醛浓度1.0%、1 mL明胶溶液固定0.3 g细胞,是最佳固定化条件;固定化细胞的最适温度37℃,最适pH 7.0,其酸碱稳定性与温度稳定性均得到了提高。综上所述,肝素黄杆菌在最佳条件下固定化后,具有较好的温度、酸碱、操作和贮藏稳定性。

重组黄杆菌肝素酶Ⅲ的纯化、表征及培养条件对酶生产的影响(英文)

肝素酶III是一种特异性地裂解乙酰肝素的酶,在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体。为实现肝素酶III的可溶性表达,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与肝素酶III融合性能,通过构建相应的表达质粒pGEX-heparinaseIII,在大肠杆菌中实现了肝素酶Ⅲ的可溶性表达。粗酶通过一步亲和纯化其纯度可达95%以上。通过对LB培养基摇瓶培养Escherichia coli BL21的诱导时机、诱导剂用量、诱导时间等培养条件的优化,确定了该可溶性肝素酶III融合蛋白的最适生产条件。通过对纯酶的最适反应温度、pH、Ca2+浓度等一系列性质研究,确定了该酶的最适反应条件。