基于UHPLC-Q-TOF/MS技术分析肿节风总黄酮提取物促进巨核细胞分化的效应成分

目的筛选肿节风总黄酮提取物促进巨核细胞分化的效应成分。方法(1)以人巨核细胞白血病细胞(Dami)与人骨髓基质细胞(HS-5)共培养的方式建立巨核细胞分化障碍模型作为评价体系,实验分组:Dami组(Dami)、对照组(Dami+HS-5)、PMA组[Dami+HS-5+5 ng·mL-1佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)]、模型组[Dami+HS-5+1%兔抗大鼠血小板血清(APS)+5 ng·mL-1PMA],培养48 h。采用流式细胞术检测巨核细胞分化成熟表面标记分子CD41a、CD61的表达情况。(2)将49只SD雄性大鼠随机分为空白血浆组、15 min组、30 min组、60 min组、90 min组、120 min组、240 min组,每组7只。各给药组大鼠灌胃肿节风总黄酮提取物1.26 g·kg^(-1),在6个设定时间点(15、30、60、90、120、240 min)采血制备肿节风总黄酮提取物经时含药血浆。(3)采用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF/MS)对肿节风总黄酮提取物经时含药血浆进行分析,以峰面积构建肿节风总黄酮提取物经时含药血浆中的化学成分随时间变化量矩阵(X矩阵)。将所采集的6个不同时间点的肿节风总黄酮经时含药血浆对巨核细胞分化成熟障碍模型进行干预,采用流式细胞术检测细胞表面分子CD41a、CD61的表达水平,构建肿节风总黄酮提取物经时含药血浆效应矩阵(Y矩阵)。(4)将X矩阵和Y矩阵数据标准化处理后,采用偏最小二乘法(Partial least squares,PLS)计算分析量效关系,以变量重要性投影(Variable importance for projection,VIP)>1为阈值,筛选与细胞表面分子CD41a、CD61变化相关的效应成分,并进行化学成分鉴定,作为肿节风总黄酮提取物中促进巨核细胞分化的潜在效应成分,最后回归评价体系验证其药效。结果(1)与Dami组比较,对照组Dami细胞表面的CD41a表达水平明显升高(P<0.05)。与对照组比较,PMA组Dami细胞表面的CD41a、CD61表达水平均显著升高(P<0.01)。与PMA组比较,模型组Dami细胞表面的CD41a、CD61表达水平均显著降低(P<0.01)。(2)与空白血浆组比较,15、30、60、90、120、240 min各时间点Dami细胞表面分子CD41a、CD61表达水平均显著升高(P<0.01),且CD41a、CD61均在30 min组表达水平最高。在正、负离子模式下筛选出VIP值>1的潜在效应成分,并选取540.3638@12.25与559.2991@11.53两个成分进行药效学验证。559.2991@11.53被鉴定为胡萝卜苷(Daucosterol,Dau),540.3638@12.25被鉴定为迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖(Rosmarinic acid 4-O-β-Dglucoside,Ros)。Ros、Dau分别干预巨核细胞分化成熟障碍模型后,与模型组比较,Ros及Dau低、中、高剂量组(40、60、80μg·mL-1)的Dami细胞表面的CD41a、CD61表达水平均显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论Ros、Dau可能是肿节风总黄酮提取物促进巨核细胞分化的效应成分。

肿节风总黄酮调节MAPK/JNK信号通路促进巨核细胞分化成熟

目的 基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/c-Jun N-末端激酶(JNK)信号通路探讨肿节风总黄酮对体外巨核细胞分化成熟障碍模型的影响及作用机制。方法 利用终浓度为5 ng·mL^(-1)的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和体积分数为1%的抗血小板血清(APS)联合作用于Dami细胞,构建体外巨核细胞分化成熟障碍模型。将细胞分为空白对照组、PMA诱导组(5 ng·mL^(-1))、APS模型组(5 ng·mL^(-1)PMA+1%APS)以及肿节风总黄酮高、中、低剂量组(15.6、7.8、3.9μg·mL^(-1)肿节风总黄酮+5 ng·mL^(-1)PMA+1%APS)。分别于培养48、72、96 h后,采用化学发光法检测细胞增殖活力。培养96 h后,采用流式细胞术检测各组Dami细胞的巨核细胞表面标志物CD41a、CD42b和CD61表达情况;采用Western Blot法检测Dami细胞MAPK/JNK信号通路关键蛋白p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun的表达情况。结果 (1)与空白对照组相比,PMA诱导组不同时间点的细胞活力均显著降低(P<0.01);与PMA诱导组相比,APS模型组48 h的细胞活力明显下降(P<0.05),但随时间延长抑制作用减弱,72、96 h的差异无统计学意义(P>0.05);与APS模型组比较,肿节风总黄酮中、高剂量组48、72 h的细胞活力均受到明显抑制(P<0.05,P<0.01),肿节风总黄酮高剂量组96 h的细胞活力受到显著抑制(P<0.01)。(2)与空白对照组比较,PMA诱导组Dami细胞表面的CD41a、CD42b和CD61表达水平均显著升高(P<0.01)。与PMA诱导组比较,APS模型组Dami细胞表面的CD41a、CD42b和CD61表达水平均显著降低(P<0.01);p-JNK/JNK及p-c-Jun/c-Jun蛋白表达显著上调(P<0.01)。与APS模型组比较,肿节风总黄酮高、中剂量组Dami细胞表面的CD41a、CD42b和CD61表达水平均显著升高(P<0.01),细胞p-JNK/JNK蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01);肿节风总黄酮低、中、高剂量组Dami细胞p-c-Jun/c-Jun蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论 肿节风总黄酮可能通过调节MAPK/JNK信号通路来改善巨核细胞分化成熟障碍。

中药肿节风不同部位中异嗪皮啶和总黄酮含量的动态分析

目的探讨肿节风不同部位中异嗪皮啶和总黄酮含量的动态变化。方法异嗪皮啶采用高效液相色谱法测定,总黄酮采用紫外分光光度法测定。结果不同季节肿节风中总黄酮和异嗪皮啶含量有一定差异,10～12月份药材中含量相对较高,叶中总黄酮含量最高,茎、根、根须中含量接近;异嗪皮啶以根中含量较高,叶中含量较低。结论采收肿节风药材在10～12月份为宜,分析肿节风药材时,样品中应包含一定比例的叶、茎、根须和根;增加对总黄酮的含量控制有重要的意义。

大孔吸附树脂分离肿节风中总黄酮的研究

目的考察11种大孔吸附树脂对肿节风总黄酮的吸附分离性能。方法采用静态吸附分离法确定适合的大孔吸附树脂;采用动态吸附分离法确定分离条件。以总黄酮吸附量、总黄酮质量分数和回收率为考察指标,采用紫外分光光度法测定总黄酮。结果HPD 400大孔吸附树脂对肿节风总黄酮有良好的吸附分离性能,其分离肿节风总黄酮的工艺条件为:肿节风总黄酮上样质量浓度为10 m g/mL,肿节风总黄酮最大吸附量为9.5 m g/mL,吸附体积流量为2.5 mL/m in,洗脱剂为70%乙醇,洗脱剂用量为3倍柱体积,树脂可重复使用3次。结论采用HPD 400大孔吸附树脂吸附分离肿节风总黄酮简便有效,总黄酮回收率为85%左右。

不同产地肿节风的薄层鉴别及总黄酮含量测定

目的探讨肿节风药材所含内酯类及黄酮类成分的整体质量控制方法。方法采用薄层色谱对乙酸乙酯提取部位进行鉴别,并结合测定总黄酮含量对药材质量进行考查。结果不同产地肿节风药材所含成分及总黄酮含量差异较大。结论薄层鉴别结合总黄酮含量测定为肿节风药材质量控制提供了依据。

肿节风总黄酮对小鼠肉瘤S_(180)的抑瘤作用

目的观察肿节风总黄酮对小鼠肉瘤S180实体瘤和腹水瘤的作用,为开发高效低毒的抗肿瘤新药提供依据。方法采用动物整体实验方法,观察肿节风总黄酮对S180荷瘤小鼠实体瘤及腹水瘤的抑瘤作用及生命延长率。结果肿节风总黄酮对S180实体瘤的抑瘤率为20.7%～60.1%,对S180腹水瘤的延长率为36.8%。结论肿节风总黄酮有一定的抗肿瘤作用及生命延长率。

紫外分光光度法测定肿节风不同部位总黄酮的含量

目的建立肿节风中总黄酮含量测定的方法并检测其不同部位总黄酮的含量。方法以芦丁为对照品,采用紫外分光光度法于500nm波长处测定肿节风中总黄酮的含量。结果芦丁质量浓度在0.3515～3.1635g/L范围内与吸光度线性关系良好(r=0.9999),平均回收率为98.78%,RSD=0.51%(n=9);其叶、茎、根中总黄酮含量分别为3.17%,2.38%,2.11%(n=5)。结论所用方法简便、准确、可靠,可作为该药材中总黄酮含量检测的方法。

肿节风总黄酮对环磷酰胺抗小鼠肉瘤S_(180)的增效减毒作用

目的:观察肿节风总黄酮对环磷酰胺(CTX)抗小鼠肉瘤S180的增效及减毒作用。方法:建立小鼠肉瘤S180动物模型,按体重随机分组,分别完成增效及减毒实验,增效实验观察肿节风总黄酮对CTX抑瘤率和体重的影响;减毒实验观察肿节风总黄酮对使用CTX时的瘤重、外周血象、胸腺和脾脏指数的影响。结果:肿节风总黄酮对小剂量CTX有显著增效作用;对使用大剂量CTX时的外周血象、胸腺和脾脏指数有显著的影响(P<0.05)。结论:肿节风总黄酮对小剂量的化疗药CTX有增效作用和对大剂量CTX有减毒作用。

肿节风总黄酮促进巨核细胞增殖的效应动力学研究

目的探讨肿节风总黄酮对体外培养巨核细胞增殖的影响及其效应动力学。方法肿节风总黄酮(0.39g·kg-1)单次灌胃给予正常SD大鼠,给药后不同时间点采血制备含药血浆。采用兔抗大鼠血小板相关抗体建立大鼠骨髓巨核细胞增殖障碍模型,并将不同时间点的含药血浆作用于该模型,以巨核细胞数、细胞上清液中血小板生成素(TPO)、转化生长因子-β1(TGF-β1)含量为效应指标,绘制时间-效应动力学曲线,计算相关动力学参数。结果肿节风总黄酮含药血浆可以显著提升巨核细胞数,肿节风总黄酮对巨核细胞数、上清液中TPO及TGF-β1的效应半衰期分别为:495.52,665.13和537.46 min,达峰时间分别为:60,90和40 min,平均驻留时间分别为:224.60,242.37和231.10 min,其中巨核细胞数与TPO含量的效应曲线之间有较好的相关性,时间上稍有滞后现象。结论肿节风总黄酮含药血浆可显著促进大鼠骨髓巨核细胞的增殖,可能与培养体系中TPO的浓度密切相关。

基于转录组学分析肿节风总黄酮抑制白血病K562细胞生长的作用机制

目的 利用转录组学技术结合体外实验揭示肿节风总黄酮抑制白血病K562细胞生长的作用机制。方法 将K562细胞分为空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)对照组及肿节风总黄酮低、中、高剂量组(25、50、100μg·mL^(-1)),干预48 h后采用化学发光法检测K562细胞活力。运用转录组测序(RNA-seq)技术对DMSO对照组和肿节风总黄酮高剂量组(100μg·mL^(-1))K562细胞进行差异表达基因(DEGs)分析;并对差异表达基因进行基因本体论(GO)功能及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。采用Western Blot法和流式细胞术验证筛选出的MAPK通路中关键蛋白的表达情况,以及细胞周期变化。结果 与DMSO对照组比较,肿节风总黄酮低、中、高剂量能够显著抑制K562细胞活力(P<0.01)。转录组分析共筛选出989个差异表达基因,其中654个上调、335个下调。KEGG通路富集分析显示,肿节风总黄酮对K562细胞的作用与MAPK信号通路、神经活性配体-受体相互作用、补体和凝血级联途径高度相关。与DMSO对照组比较,高剂量肿节风总黄酮能够显著降低K562细胞的p-JNK、CDC20蛋白表达水平(P<0.01),升高P53、CDKN1A蛋白表达水平(P<0.01),明显阻滞K562细胞在G0/G1期(P<0.01)。结论 肿节风总黄酮可能通过降低MAPK信号通路中JNK蛋白磷酸化水平,上调P53、CDKN1A蛋白表达,下调CDC20蛋白表达,阻滞细胞周期,进而抑制白血病K562细胞的生长活性。

肿节风总黄酮对阿糖胞苷诱发小鼠S_(180)血小板减少模型的影响

目的:观察肿节风总黄酮对阿糖胞苷诱发小鼠肉瘤S180血小板减少模型的影响。方法:通过腹腔注射阿糖胞苷100 mg/kg,1次/d,连续2 d,第3天改用50 mg/kg作为维持剂量继续腹腔注射,1次/d,连续3 d。每天灌胃给予肿节风总黄酮,连续10 d,于实验第3、5、7、10天测定白细胞及血小板。结果:腹腔注射阿糖胞苷可在第7天成功造成血小板减少模型,肿节风总黄酮可显著升高白细胞和血小板(P<0.01)。结论:阿糖胞苷可成功造成荷瘤鼠血小板减少模型,肿节风总黄酮可显著升高血小板。

肿节风总黄酮对阿糖胞苷诱发小鼠血小板减少症模型的影响

目的利用阿糖胞苷建立化疗后血小板减少小鼠模型,研究肿节风总黄酮对化疗后血小板减少小鼠模型的治疗效果及机制。方法小鼠注射阿糖胞苷造成血小板减少模型,并通过对肿节风及其各分离部位进行灌胃用药,就肿节风总黄酮对小鼠外周血象变化进行观察。结果小鼠经注射阿糖胞苷造模后,模型组血小板数显著低于正常对照组,数据差异具有统计学意义(P驥0.05);肿节风总黄酮中剂量组、阳性药强的松龙组PLT显著高于模型组,数据差异具有统计学意义(P驥0.05);阳性药强的松龙组WBC显著低于正常对照组,数据差异具有统计学意义(P驥0.05);而MPV、RBC、HGB与正常对照组相比,数据差异无显著性(P驦0.05),阿糖胞苷对其无影响。结论阿糖胞苷能够有效造成小鼠血小板减少模型,肿节风总黄酮能够明显对血小板起到提升作用。

肿节风总黄酮对化疗所致血小板减少模型小鼠骨髓SDF-1和CXCR-4表达的影响

目的利用阿糖胞苷建立化疗所致血小板减少症小鼠模型,研究肿节风总黄酮对模型小鼠外周血小板数目以及骨髓微环境中基质细胞衍生因子1(SDF-1)及其受体趋化因子受体4(CXCR-4)表达的影响。方法将60只KM小鼠按血小板数目随机分为正常对照组,阿糖胞苷模型组,醋酸泼尼松龙组(10.0 mg·kg^(-1)),肿节风总黄酮高、中、低剂量组(94.5,63.0,31.5 mg·kg^(-1))。采用腹腔注射阿糖胞苷建立化疗所致血小板减少症小鼠模型,同时给予相应药物干预。动态检测外周血小板数量,实验结束时检测骨髓中巨核细胞状况,免疫组化检测骨髓中SDF-1及其受体CXCR-4的表达。结果与正常组比较,模型组外周血小板数量、巨核细胞数目及多倍体比例均明显降低(P<0.01);与模型组比较,各给药组都能显著提升外周血小板数目和巨核细胞数目(P<0.01),同时肿节风总黄酮高、中剂量组还可以提高多倍体巨核细胞所占比例(P<0.01);肿节风总黄酮高、中剂量组可显著促进骨髓中SDF-1以及巨核细胞中相应受体CXCR-4的表达(P<0.01,P<0.05)。结论肿节风总黄酮能显著提升阿糖胞苷诱导的血小板减少症模型小鼠外周血小板数目,其作用机制可能与增加骨髓中SDF-1及其受体CXCR-4的表达,从而促进巨核细胞增殖、分化和形成血小板有关。

肿节风浸膏中的总黄酮和香豆素部位的谱图指纹差异研究

目的:比较大孔吸附树脂分离的肿节风浸膏中的总黄酮部位和香豆素部位的谱图指纹差异。方法:采用指纹图谱技术,建立了肿节风浸膏的指纹图谱。结果:总黄酮部位与香豆素部位的特征指纹的峰数量和峰面积有差异。结论:大孔吸附树脂能较好地分离药物的药效部位,谱图指纹能较好地表征药效部位。

肿节风总黄酮对细胞共培养体系中巨核细胞分化、成熟的影响

目的研究肿节风总黄酮对细胞共培养体系中巨核细胞分化、成熟的影响。方法通过体外分离培养SD大鼠骨髓基质细胞和巨核细胞,构建共培养体系模拟骨髓微环境,加入兔抗大鼠血小板血清(APS)建立巨核细胞分化障碍模型,以肿节风总黄酮高、中、低剂量(7.80、3.90、1.95μg·mL^-1)进行干预。分别采用瑞氏-吉姆萨染色、流式细胞术检测各组共培养体系中巨核细胞的多倍体化程度、细胞表面标志物CD61表达量,以及基质细胞凋亡情况;以酶联免疫吸附法(ELISA)检测血小板生成素(TPO)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、转化因子-β1(TGF-β1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)含量。结果与正常组比较,APS模型组共培养体系中巨核细胞多倍体数目、CD61表达量以及TPO、SDF-1、VCAM-1含量均明显降低(P<0.01),TGF-β1含量明显上调(P<0.05),基质细胞凋亡率显著提高(P<0.01)。与APS模型组比较,肿节风总黄酮高、中、低剂量组能显著增加共培养体系中TPO的含量(P<0.01);肿节风总黄酮高、中剂量组能显著提高巨核细胞多倍体数目及SDF-1含量(P<0.05,P<0.01);肿节风总黄酮高剂量组能显著提高CD61表达量(P<0.05),降低共培养体系中基质细胞的凋亡率及TGF-β1含量(P<0.05,P<0.01)。结论肿节风总黄酮能促进共培养体系中巨核细胞的分化、成熟,可能与其改善共同培养体系中基质细胞状态和分泌功能,影响微环境中促巨核细胞分化的细胞因子含量关系密切。

肿节风总黄酮体治疗晚期胰腺癌初步观察

作者采用肿节风总黄酮体治疗晚期胰腺癌5例,结果证明具有改善症状,部分病例表现为缩小肿块作用,以及延长生存期(7个月)的作用,长期服用无副作用,是一种有希望的抗癌中草药。

肿节风总黄酮对溴酸钾诱发小鼠肾损伤的保护作用

目的探讨肿节风总黄酮对溴酸钾诱发小鼠肾损伤的保护作用。方法 200mg.kg-1溴酸钾腹腔注射诱发小鼠肾损伤模型,观察肿节风总黄酮给药后对肾损伤的保护作用。采用HPLC法测定小鼠血清中肌酐含量及肾组织中谷胱甘肽含量,分光光度法测定小鼠肾组织中丙二醛含量和谷胱甘肽过氧化物酶活力,Griess反应法测定血浆及肾组织的一氧化氮含量。结果与肾损伤模型组相比,肿节风总黄酮可以有效降低血清肌酐水平和肾组织中丙二醛含量,对血浆及肾组织中一氧化氮水平的升高也有一定的改善作用,同时可提高肾损伤小鼠肾组织的谷胱甘肽及谷胱甘肽过氧化物酶水平。结论肿节风总黄酮对溴酸钾诱发的小鼠肾损伤具有一定的保护作用,其作用机制可能与肿节风总黄酮通过清除自由基缓解溴酸钾诱发的肾组织氧化应激状态有关。

肿节风中总黄酮大孔树脂吸附-脱吸附动力学研究

目的考察肿节风水提取液中总黄酮在HPD-100型树脂上的吸附与脱吸附动力学过程。方法用紫外分光光度计测定肿节风水提液上柱吸附的流出液与洗脱液中总黄酮含量,绘制总黄酮在HPD-100型树脂上的泄漏曲线与洗脱曲线。结果肿节风总黄酮在HPD-100型树脂柱上的饱和吸附量约为每g干树脂10 mL,以4 BV的50%乙醇洗脱液洗脱基本完全。结论肿节风总黄酮在大孔树脂上的吸附-脱吸附动力学研究,可为确定大孔树脂分离纯化工艺条件(吸附终点与洗脱终点)提供科学依据。

基于大孔吸附树脂富集法的肿节风粗黄酮纯化研究

[目的]筛选适用于肿节风(Sarcandra glabra)粗黄酮类物质纯化的大孔吸附树脂。[方法]比较12种大孔吸附树脂对肿节风总黄酮的静态吸附率和解吸率,用不同梯度浓度的乙醇洗脱HPD-600大孔吸附树脂,并计算总黄酮回收率和纯度。[结果]HPD-600大孔吸附树脂的回收率为86.56%,纯度可达68.7%。[结论]HPD-600树脂综合性能良好,适用于肿节风粗黄酮类物质的分离纯化。

基于脾脏代谢组学研究肿节风总黄酮治疗免疫性血小板减少症的作用机制

目的运用代谢组学技术研究肿节风总黄酮干预免疫性血小板减少症(ITP)的作用机制。方法48只雄性SD大鼠使用Excel随机函数分为正常对照组,模型组,肿节风总黄酮低、中、高剂量组和醋酸泼尼松龙组,每组8只。除正常对照组外,其他各组大鼠第1、3、4、6、7、8天腹腔注射兔抗大鼠血小板血清(5 mL/kg)复制ITP大鼠模型,正常对照组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。造模日同时给药干预,每日1次。肿节风总黄酮低、中、高剂量组分别灌胃肿节风总黄酮(31.5、63.0、94.5 mg/kg),醋酸泼尼松龙组腹腔注射醋酸泼尼松龙(10.0 mg/kg)。第0、3、6、9天检测各组大鼠外周血小板数量,第10天称量脾脏质量,并计算脾脏指数。利用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱技术和多元统计分析对各组大鼠脾脏差异代谢物进行筛选和鉴定,并进行通路富集分析。结果与正常对照组比较,模型组大鼠第6、9天外周血小板减少,脾脏质量增加,脾脏系数升高(P<0.05)。与模型组比较,肿节风总黄酮低、中、高剂量组第6、9天外周血小板数量增加,肿节风总黄酮高剂量组脾脏质量减少,肿节风总黄酮中、高剂量组脾脏指数降低(P<0.05)。脾脏代谢组学分析筛选得到24种与ITP相关的生物标志物,肿节风总黄酮高剂量组可以回调其中的21种,主要涉及亚油酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油磷脂代谢。结论肿节风总黄酮可能通过调节脾脏亚油酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油磷脂代谢等代谢通路恢复免疫系统的正常调节能力,以抑制血小板过度破坏,发挥治疗ITP的作用。