菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用

为研究菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用,本研究将铜绿假单胞菌的flgE基因克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+)中制备DNA疫苗,分别以该DNA疫苗(100μg/只)和菊粉佐剂+DNA疫苗免疫BALB/c小鼠(质粒100μg/只,终浓度20%菊粉),同时设置菊粉灌胃对照组(600 mg/kg)以及灭活疫苗(100μL/只)、鞭毛蛋白(100μL/只)、pcDNA3.1(+)空载体(100μg/只)和PBS对照组(100μL/只)。每两周免疫一次,共免疫3次。利用间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平,双抗夹心ELISA检测IFN-γ分泌情况,计算强毒攻击后各组小鼠的存活数及保护率。结果显示,菊粉佐剂组和菊粉灌胃组小鼠产生的抗体水平与DNA疫苗组相比无明显差异(p>0.05),且显著低于灭活疫苗组和鞭毛蛋白组(p<0.05);菊粉佐剂组对小鼠脾淋巴细胞的刺激值(SI值)和IFN-γ水平与鞭毛蛋白组相当,明显高于菊粉灌胃组和DNA疫苗组(p<0.05);菊粉佐剂组和菊粉灌胃组对小鼠的保护率均高于DNA疫苗组,但低于灭活疫苗组,表明以菊粉预先灌胃和以菊粉为佐剂均可在一定程度上提高flgE基因DNA疫苗对小鼠的保护效率,但仍不及传统的灭活疫苗。本实验为铜绿假单胞菌DNA疫苗的研究及菊粉在DNA疫苗中的应用奠定基础。

铜绿假单胞菌flgE基因PCR检测方法的初步建立

为建立一种基于铜绿假单胞菌flgE基因的PCR检测方法,本试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌flgE基因序列,设计合成了1对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了目的基因。从退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度5个方面优化了反应条件,并检测了该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增出了铜绿假单胞菌1 400 bp的flgE特异性基因片段,最佳退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度分别为56℃、30个循环、1.6 mmol/L、0.2 mmol/L和0.3μmol/L。特异性试验表明,仅铜绿假单胞菌中可扩增出目的片段,而多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中均未扩增出相应片段。敏感性试验结果表明,本方法可检测到最低10 pg/μL的铜绿假单胞菌基因组DNA以及100 CFU/mL的病原菌。

铜绿假单胞菌flg E基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果评估

为评价铜绿假单胞菌flgE基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果,本研究经PCR扩增flgE基因,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建flgE基因的重组质粒pflgE,进一步以壳聚糖为佐剂制备了纳米DNA疫苗CpflgE,通过测定OD260nm值检测纳米DNA疫苗的包封率、加入DNA酶后经琼脂糖凝胶电泳检测其抗DNA酶降解的能力、37℃恒温静置1 d,3 d和5 d后经琼脂糖凝胶电泳检测稳定性。结果显示CpflgE的包封率为94.69%,可有效抵抗DNaseⅠ的降解,具有较强的稳定性。以pflgE和CpflgE免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,同时设置灭活疫苗免疫组、铜绿假单胞菌鞭毛蛋白亚单位疫苗免疫组以及PBS对照组。免疫后不同时间经间接ELISA测定各组小鼠血清抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平,采用检测试剂盒测定各组小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的水平。结果显示,Cpflg E诱导小鼠的血清抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平及血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的浓度总体上虽均低于灭活疫苗,但与鞭毛蛋白亚单位疫苗相当,且显著高于pflgE (P<0.05)。三免两周后以铜绿假单胞菌强毒株(1.35×10^(10)cfu)对各组小鼠进行攻毒试验,测定攻毒后各组小鼠的保护率,结果显示,pflgE组、CpflgE组、鞭毛蛋白疫苗组和灭活疫苗组的保护率分别为57.1%、76.2%、81%和95.2%。本研究首次证实壳聚糖作为载体和佐剂可以显著提高铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗诱导的免疫应答水平,为铜绿假单胞菌新型DNA疫苗的研制提供了参考依据。