鞭毛主调控因子flhDC调控机制及其在PGPR定殖中的功能

细菌鞭毛结构和组装的高度复杂性要求鞭毛在合成过程中遵循严格的级联调控。flhDC位于级联调控的顶端,是革兰氏阴性菌鞭毛生物合成的主要调节因子。flhDC在调控鞭毛运动以应对外界环境和营养变化的同时也受到全局性调控、群体感应、新陈代谢和环境信号等因素的影响。根际生防微生物制剂的合理使用可以降低化学肥料和杀虫剂对土壤的污染。能够在植物根部定殖是植物生长促进根际细菌(PGPR)促生的前提,flhDC在此过程中发挥着不可或缺的作用。本文综述了革兰氏阴性菌中鞭毛主调控因子flhDC在转录水平、mRNA翻译水平、翻译后水平受到的多重调节,讨论了flhDC在PGPR植物根表定殖过程中发挥的作用,主要包括flhDC调控PGPR运动性,参与PGPR生物膜合成,提高PGPR在植物根表定殖的稳定性。

一种lacZ报告基因T载体的构建及其在沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC表达活性测定中的应用

为研究5'-非翻译区(UTR)对沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC表达的影响,本研究以鼠伤寒沙门氏菌542(STM542)基因组DNA为模板,扩增含不同长度5'-UTR的flhDC全长基因(共5种),并将其克隆至含阿拉伯糖启动子的质粒PBAD33中。通过测定含阿拉伯糖的半固体平板上包含不同长度flhDC基因的重组大肠杆菌菌落的直径,初步评估不同5'-UTR调控序列对flhDC基因表达的影响。为精确测定不同调控序列的活性差异,本实验室进一步构建了以lacZ为报告基因的T载体,并将扩增的对应于前4种flhDC基因调控序列片段克隆于构建的T载体,通过测定其β-半乳糖苷酶活性获得相应调控序列的活性参数。结果显示,在阿拉伯糖诱导下,对应于1572bp的flhDC基因片段的调控序列活性最低,对应于1201bp的flhDC基因片段的调控序列活性最高,本实验为进一步研究flhDC基因的调控功能奠定基础。

水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

【目的】水稻细菌性基腐病(致病菌Dickeya zeae)是水稻重要细菌病害之一。细菌的鞭毛是重要的运动器官,迄今有关水稻基腐病菌的鞭毛系统、flh DC和fli A基因功能及其调控机理尚不清楚,明确这些鞭毛基因的功能,有利于进一步了解D.zeae的致病性综合调控网络、开发新型药物作用靶标以及制定病害防控策略。论文旨在明确D.zeae鞭毛系统中flh DC和fli A在致病性中的作用。【方法】以D.zeae野生型致病菌株EC1基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增待敲除的目标基因flh DC和fli A各自的上、下游片段,再以混合的上、下游片段为模板,扩增得到缺失flh DC和fli A的融合片段,双酶切纯化后连接到自杀性载体p KNG101上,构建带有反向筛选标记基因sac B的自杀重组质粒p KNG-Δflh DC和p KNG-ΔfliA,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过两次等位基因同源重组,PCR检测和测序验证,最终获得目标基因flh DC和fli A缺失突变体Δflh DC和ΔfliA;测定并比较突变体与野生菌的胞外酶活性、毒素活性、运动性、生物膜形成能力,以及对水稻的致病力和对烟草的过敏性反应(HR);进一步提取细菌总RNA,以16Sr DNA为内参来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,比较野生菌和突变体Δflh DC和ΔfliA下游基因flh D、flh C、fli A和fli C的表达量差异。【结果】通过基因操作手段成功构建了基因缺失突变体Δflh DC和ΔfliA。表型测定结果显示,野生菌EC1的运动性和形成生物膜的能力很强,而基因缺失菌株Δflh DC和ΔfliA的运动性和形成生物膜的能力明显下降;野生菌株EC1对水稻种子萌发具有很强的抑制作用,而突变体Δflh DC和ΔfliA则显著降低了对水稻种子萌发的抑制作用;接种野生菌株EC1的水稻植株产生大面积褐色病斑,且腐烂程度严重,而接种突变体Δflh DC和ΔfliA的水稻植株只在接种的针刺部位周围出现水渍状褐色病斑,腐烂程度轻微,说明突变体菌株Δflh DC和ΔfliA显著降低了对水稻植株上的致病力。进一步的表型测定结果显示,突变体菌株Δflh DC和ΔfliA与野生菌EC1在产生胞外致病酶、毒素以及引起烟草HR能力等方面没有显著差异。q RT-PCR分析结果显示,在突变体菌株Δflh DC中,flh D和flh C不表达,fli A和fli C的表达量较野生菌明显下降;而在突变体ΔfliA中,flh D、flh C和fli A均不表达,fli C表达明显下降。【结论】调控细菌鞭毛基因表达的主调控因子flh DC操纵子,以及表达鞭毛特异性因子σ^(28)基因fli A,是细菌鞭毛系统基因簇的重要组分。flhDC和fliA显著影响D.zeae的运动性和生物膜形成能力,并显著影响水稻种子的萌发功能,在水稻基腐病菌的致病性中起重要作用。

沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达致死大肠杆菌的初探

为探究沙门氏菌鞭毛主调控基因flhDC过表达对大肠杆菌宿主菌的影响,本研究将鼠伤寒沙门氏菌flhDC基因克隆于具有超强调控能力的pN15E6质粒中,通过观察重组大肠杆菌在对照和含IPTG诱导剂培养基中的生长情况,初步判定flhDC基因过表达对大肠杆菌的影响。结果显示过表达flhDC双基因致死大肠杆菌宿主菌,而过表达flhD或flhC单个基因不致死宿主菌,同一细胞中同时过表达flhD和flhC两个基因致死宿主菌;为探究沙门氏菌flhDC基因在大肠杆菌中的调控功能,本实验将flhDC基因克隆于具有严谨调控能力的p BAD33质粒中,通过测定含不同浓度阿拉伯糖半固体培养基上重组大肠杆菌菌落的直径,评估沙门氏菌flhDC在大肠杆菌宿主菌中调控鞭毛活性的能力。结果显示在一定范围内随着阿拉伯糖诱导剂浓度的提高,重组菌动力增大。表明沙门氏菌flhDC基因在低浓度表达时可以促进大肠杆菌宿主菌鞭毛活性。本实验为进一步研究flhDC基因过表达致死宿主菌的机理奠定了基础。

大肠杆菌鞭毛调控基因flhDC与生物材料植入感染的研究进展

随着生物材料被广泛应用于临床,生物材料植入感染成为令人棘手的常见医院内感染,有报道占院内感染的50%,大肠杆菌是临床以生物材料为中心感染的优势菌种。生物材料表面的细菌生物膜使其膜内细菌能有效抵御抗生素治疗和机体的防御反应,是导致生物材料为中心感染难以控制的根源。大肠杆菌的运动性与细菌生物膜形成密切相关,鞭毛是大肠杆菌的运动器官,鞭毛的生成需要三级基因的表达,操纵子flh DC编码鞭毛生成的一级主调控基因。我们推测:"鞭毛调控基因flh DC的表达→鞭毛的生成→细菌的运动性→细菌生物膜形成"之间存在着一一对应的关系,这为临床防治生物材料植入感染提供新思路。本文就以大肠杆菌鞭毛调控基因flh DC与生物材料植入感染做一简要综述。

假结核耶尔森氏菌flhDC基因影响细菌运动性和生物膜形成

假结核耶尔森氏菌YPIII鞭毛系统的一级主调控基因flhDC缺失突变,所得突变株在细菌泳动实验中丧失了泳动能力;对fliA启动子融合报告菌株的检测发现,与大肠杆菌一样,在假结核耶尔森氏菌中二级调控基因fliA的表达也受到flhDC的调控;对野生型和突变株在非生物活性表面和生物活性表面生物膜形成的观察和统计表明,flhDC突变株在不同表面上生物膜的形成明显减少,并降低了对线虫表面侵染的严重度.以上结果表明,flhDC的突变不仅直接使YPIII的运动性丧失,而且影响了细菌在不同表面上生物膜的形成,这一新功能的鉴定为细菌生物膜形成机制的研究提供了新的视点.

The flhDC gene affects motility and biofilm formation in Yersinia pseudotuberculosis

The flagella master regulatory gene flhDC of Yersinia pseudotuberculosis serotype III (YPIII) was mu- tated by deleting the middle region and replaced by a tetracycline resistant gene, and the subsequent mutant strain named YPIII?flhDC was obtained. Swimming assay showed that the swimming motility of the mutant strain was completely abolished. The promoter region of the flagella second-class regula- tory gene fliA was fused with the lux box, and was conjugated with the mutant and the parent strains respectively for the first cross. LUCY assay result demonstrated that flhDC regulated the expression of fliA in YPIII as reported in E. coli. Biofilm formation of the mutant strain on abiotic and biotic surfaces was observed and quantified. The results showed that mutation of flhDC decreased biofilm formation on both abiotic and biotic surfaces, and abated the infection on Caenorhabdtis elegans. Our results suggest that mutation of the flagella master regulatory gene flhDC not only abolished the swimming motility, but also affected biofilm formation of YPIII on different surfaces. The new function of flhDC identified in this study provides a novel viewpoint for the control of bacterial biofilm formation.

Stx2噬菌体溶原对大肠杆菌运动性及其相关基因表达的影响

【目的】通过基因缺失和噬菌体溶原转换研究大肠杆菌运动相关基因flhDC、fliA、fliD和fliE对Stx2噬菌体ΦMin27溶原菌的影响。【方法】本实验利用Red重组酶系统,构建了大肠杆菌MG1655的缺失株MG1655△flhDC、MG1655△fliA、MG1655△fliD及MG1655△fliE,并将flhDC片段、fliA片段、fliD片段和fliE片段连接pUC18后分别转化相应的突变株,得到相应的互补菌株。通过Stx2噬菌体ΦMin27的感染获得各缺失株的溶原株MG1655△flhDCФMin27、MG1655△fliAФMin27、MG1655△fliDФMin27及MG1655△fliEФMin27。随后测定了野生株、缺失株、互补株和溶原株的运动能力,并通过荧光定量PCR分析了flhDC缺失前后野生株和溶原株其他运动相关基因表达量的变化。【结果】Stx2噬菌体ФMin27溶原感染可促进MG1655的fliA和fliD基因的表达,增强宿主菌MG1655的运动特性;MG1655在flhDC基因缺失的状态下,fliA和fliD基因的表达同步出现上调,但运动性未发生变化,而MG1655△flhDC溶原菌丧失了运动特性,基因转录水平检测发现MG1655△flhDCФMin27与MG1655△flhDC相比,fliA和fliD基因的表达同步出现显著下调,而对fliE基因的表达几乎没有影响。fliA、fliD和fliE单个基因的缺失对大肠杆菌MG1655和Stx2噬菌体ΦMin27溶原菌的运动性几乎没有影响。【结论】提示fliA和fliD基因共同参与了鞭毛运动的调控,flhDC基因可影响噬菌体溶原菌株的运动性,为进一步研究噬菌体溶原与宿主基因之间的相互调节作用提供理论依据。