水稻基腐病菌flhDC和fliA基因的功能

【目的】水稻细菌性基腐病(致病菌Dickeya zeae)是水稻重要细菌病害之一。细菌的鞭毛是重要的运动器官,迄今有关水稻基腐病菌的鞭毛系统、flh DC和fli A基因功能及其调控机理尚不清楚,明确这些鞭毛基因的功能,有利于进一步了解D.zeae的致病性综合调控网络、开发新型药物作用靶标以及制定病害防控策略。论文旨在明确D.zeae鞭毛系统中flh DC和fli A在致病性中的作用。【方法】以D.zeae野生型致病菌株EC1基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增待敲除的目标基因flh DC和fli A各自的上、下游片段,再以混合的上、下游片段为模板,扩增得到缺失flh DC和fli A的融合片段,双酶切纯化后连接到自杀性载体p KNG101上,构建带有反向筛选标记基因sac B的自杀重组质粒p KNG-Δflh DC和p KNG-ΔfliA,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过两次等位基因同源重组,PCR检测和测序验证,最终获得目标基因flh DC和fli A缺失突变体Δflh DC和ΔfliA;测定并比较突变体与野生菌的胞外酶活性、毒素活性、运动性、生物膜形成能力,以及对水稻的致病力和对烟草的过敏性反应(HR);进一步提取细菌总RNA,以16Sr DNA为内参来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法,比较野生菌和突变体Δflh DC和ΔfliA下游基因flh D、flh C、fli A和fli C的表达量差异。【结果】通过基因操作手段成功构建了基因缺失突变体Δflh DC和ΔfliA。表型测定结果显示,野生菌EC1的运动性和形成生物膜的能力很强,而基因缺失菌株Δflh DC和ΔfliA的运动性和形成生物膜的能力明显下降;野生菌株EC1对水稻种子萌发具有很强的抑制作用,而突变体Δflh DC和ΔfliA则显著降低了对水稻种子萌发的抑制作用;接种野生菌株EC1的水稻植株产生大面积褐色病斑,且腐烂程度严重,而接种突变体Δflh DC和ΔfliA的水稻植株只在接种的针刺部位周围出现水渍状褐色病斑,腐烂程度轻微,说明突变体菌株Δflh DC和ΔfliA显著降低了对水稻植株上的致病力。进一步的表型测定结果显示,突变体菌株Δflh DC和ΔfliA与野生菌EC1在产生胞外致病酶、毒素以及引起烟草HR能力等方面没有显著差异。q RT-PCR分析结果显示,在突变体菌株Δflh DC中,flh D和flh C不表达,fli A和fli C的表达量较野生菌明显下降;而在突变体ΔfliA中,flh D、flh C和fli A均不表达,fli C表达明显下降。【结论】调控细菌鞭毛基因表达的主调控因子flh DC操纵子,以及表达鞭毛特异性因子σ^(28)基因fli A,是细菌鞭毛系统基因簇的重要组分。flhDC和fliA显著影响D.zeae的运动性和生物膜形成能力,并显著影响水稻种子的萌发功能,在水稻基腐病菌的致病性中起重要作用。

延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因克隆及生物信息学分析

根据气肿疽鞭毛基因(GenBank登录号:AB058932)的参考序列,PCR扩增并克隆延边株气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA基因。成功克隆后测序,并采用生物信息学方法对鞭毛蛋白FliA基因的蛋白质二级结构、结构功能域、三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析。结果表明:与AB058932序列相比,存在38处突变,核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均为97%;FliA蛋白的理论等电点为6.99,不存在跨膜区和信号肽序列,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,主要有15个潜在B细胞抗原表位区,17个限制性CTL抗原表位区。本试验为延边株气肿疽FliA蛋白功能的深入研究奠定了基础。

气肿疽延边株FliA基因真核表达载体的构建

为构建气肿疽延边株FliA基因的真核表达载体PVAX1-FliA,根据Genbank气肿疽鞭毛基因(登录号:AB058932)的参考序列,利用Primer 5.0设计1对引物,通过PCR扩增出完整的气肿疽延边株FliA基因。将目的基因与pMD-19T载体连接转化到大肠杆菌DH5α,进行测序、PCR、双酶切鉴定阳性克隆质粒。用回收后的基因与真核表达载体PVAX-1连接,并经双酶切、测序鉴定。本试验成功构建了鞭毛基因的重组真核表达载体PVAX1-FliA,为探讨气肿疽延边株FliA基因的分子生物学特性和功能及免疫新途径提供依据。

气肿疽梭菌不同靶基因检测方法的比较

为检测牛、羊等反刍动物的气肿疽梭菌,筛选出更为特异、敏感的PCR检测方法,分别以fli A(C)、nan A、cct A为靶基因进行PCR检测,并对其敏感性、特异性等方面进行比较。结果表明,以cct A为靶基因的PCR检测方法敏感性最高,最小检测DNA量为12.30×10^(-5)pg/μL;以fli A(C)、nan A为靶基因的PCR检测方法敏感性较低,最小检测DNA量为0.123 ng/μL;3种靶基因引物菌未扩增出D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌等基因片段,具有较好的特异性。本试验为气肿疽的快速诊断提供了更为敏感、特异的检测技术。

低分子肝素注射剂质量评价

目的:考察低分子肝素注射剂的质量现状及存在问题,对现行质量标准的科学性及检验方法进行研究。方法:采用现行标准对抽验样品进行法定检验;建立并完善了多个检验方法:(1)建立微量生色底物法测定抗Xa因子和抗IIa因子活性;(2)完善分子量与分子量分布校正曲线建立方法;(3)建立阴离子交换色谱法检查有关物质;(4)建立激光光散射法测定绝对分子量;(5)与进口原研厂制剂进行质量比对;(6)对生产企业进行实地调研。结果:个别样品不符合标准规定,分子量与分子量分布、抗Xa因子与抗IIa因子活性为主要的不合格项,各生产企业质量标准与产品质量差异大,国产低分子肝素与进口制剂差距较大;样品经亚硝酸降解后,杂质硫酸皮肤素和多硫酸软骨素分离度大于3.0,所有样品均未检出多硫酸软骨素,硫酸皮肤素含量小于2.0%;激光光散射法对低分子肝素分子量对照品的建立有重要意义;生产企业对关键质控项目的检验能力有待提高。结论:大部分国产低分子肝素注射剂能符合现行质量标准要求;现行标准未对低分子肝素进行分类管理,标准较低;作为仿制药,国产低分子肝素注射剂在产品质量与质量标准上均与国外原研厂有较大差距,亟待提高。