鸭源致病性大肠杆菌耐氟苯尼考floR基因的克隆与序列分析

为调查鸭源致病性大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的存在情况,利用PCR对20株临床分离的耐氟苯尼考的致病性大肠杆菌进行floR分子检测,分子检测结果显示,全部菌株floR基因阳性;对其中2株大肠杆菌的氟苯尼考耐药基因floR进行了克隆和测序,结果表明,鸭源大肠杆菌floR基因片段的克隆测序结果与预期所得片段结果相符,长度为753 bp,2株鸭源大肠杆菌floR基因的同源性为99.6%,与牛源、鸡源等floR基因的同源性为84.8%-99.9%。系统发育分析发现,2株鸭源大肠杆菌floR基因不在同一支上,亲缘关系较远,表明floR基因的亲缘关系与该基因的来源动物无关。

实时荧光定量PCR检测沙门菌flor基因和sul2基因方法的建立

目的建立一种fl or基因和sul2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,为检测沙门菌的耐药性以及耐药基因分子流行病学调查奠定基础。方法以氟苯尼考、复方磺胺甲噁唑抗性的沙门菌菌株为材料,根据Gen Bank中登陆的沙门菌fl or和sul2基因序列,设计并合成引物,建立基于SYBR Green I染料技术的Real-Time PCR检测体系,绘制出标准曲线并对其溶解曲线进行分析。结果以pMD18-T为载体构建的标准品的Ct值与样品的浓度的对数在一定范围内呈现良好的线性关系,两基因的检测域值较小,fl or基因可以检测到102 copies/μL的样品,sul2基因可以检测到103 copies/μL的样品,经耐药性与基因表达量相关分析,耐药性较高的菌株其fl or基因、sul2基因表达量也较高。结论建立的检测沙门菌中fl or基因和sul2基因的荧光定量PCR方法具有很好的灵敏性、特异性和重复性,可以广泛用于临床中fl or和sul2两种基因的检测以及沙门菌耐药分子流行病学的调查。

氟苯尼考耐药基因floR LAMP检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且可定量检测氟苯尼考耐药基因floR的环介导等温扩增方法(LAMP),根据GenBank登录的革兰阴性菌floR基因保守序列,利用PrimerExploerV4设计特异性LAMP引物,成功建立了快速检测氟苯尼考耐药floR基因的LAMP方法。该LAMP检测方法反应温度为63℃,反应时间为60min,具有可实时监测反应、定量检测出floR基因的拷贝数,以及操作简便的特点,灵敏度高,检测限为6.24×100拷贝,是普通PCR的100倍。用建立的方法检测对氟苯尼考不同敏感性的大肠埃希菌floR基因,结果显示,对氟苯尼考敏感、中介和耐药的菌株均检测到floR基因,其拷贝数与菌株MIC相关,提示floR基因不仅存在于氟苯尼考耐药菌中。所建立的floR基因LAMP检测方法可为floR基因的监测,以及氟苯尼考耐药性产生和传播机制的研究提供新的技术手段。

牛源致病性大肠杆菌floR基因的克隆、表达及其抗体的制备

将耐氟苯尼考大肠杆菌的floR基因部分基因片段插入pGEX-4T-2原核表达载体中,构建以BL21(DE3)Codon Plus为宿主菌的原核表达体系。通过优化诱导条件,确定了floR1基因能在pGEX/BL21(DE3)codon plus中高效表达,且表达的重组蛋白为包涵体形式。对包涵体进行溶解复性后,将复性融合蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-FloR1融合蛋白。并以GST-FloR1融合蛋白为抗原免疫小鼠,成功制备出抗GST-FloR1融合蛋白的抗体。抗体的制备为FloR蛋白定位及其对氟苯尼考药物泵出功能抑制的研究奠定了基础。

不同菌属的氟苯尼考耐药特点及floR基因的序列分析

为了解福建宁德地区猪源细菌对氟苯尼考耐药性及耐药基因floR的遗传特性。本研究从宁德地区6个猪场分别采集了50份仔猪粪便样品。从中分离得到氟苯尼考耐药大肠杆菌17株、沙门氏菌2株、肺炎克雷伯菌5株和鲍曼不动杆菌8株。并对其耐药基因floR进行同源性分析。结果显示:宁德地区猪源大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对氟苯尼考的耐药检出率分别为34%、4%、10%和16%。且所有的分离细菌都呈现了多重耐药性。同源性分析发现不同细菌间的耐药基因floR存在高度同源性。这些结果表明氟苯尼考耐药基因floR广泛存在于不同细菌间,且可在不同细菌间进行水平传播。该研究为氟苯尼考耐药基因floR的广泛传播奠定了一定的理论基础,对临床合理用药提供了依据。

猪源大肠杆菌floR、CTX-M、mcr-1耐药基因多重PCR检测方法的建立

为了建立猪源大肠杆菌对氟苯尼考、β-内酰胺类与粘杆菌素耐药基因的多重PCR检测方法,本研究以氟苯尼考耐药基因floR、β-内酰胺耐药基因CTX-M、粘杆菌素耐药基因mcr-1作为目的基因,设计3对特异性引物,通过对多重PCR反应体系及条件的优化,成功建立了多重PCR检测方法。该方法的灵敏度为1.46×10^5CFU/m L,具有高度特异性、敏感性和可重复性。本方法的建立为大肠杆菌中常见耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段。

湖北省鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌(RA)感染引起的一种雏鸭高度接触性传染病。为了解该病在鸭群中的发病情况、细菌耐药性变化,本研究从湖北省不同地区鸭场采集鸭传染性浆膜炎疑似病例肝脏,分离到34株细菌,对分离细菌进行培养、形态观察、生化鉴定、耐药性检测和氟苯尼考耐药基因测定。药敏试验显示34株分离株对头孢噻肟、大观霉素和阿米卡星敏感性比较高,对新霉素和诺氟沙星耐药性最强。PCR扩增RA氟苯尼考flor基因,16株分离株可以扩增出该基因,所得序列与Flor蛋白全基因序列比对,相似性高达100%。

猪胸膜肺炎放线杆菌新疆株分离鉴定及生物学特性研究

新疆南疆某规模猪场发生疑似猪传染性胸膜肺炎,为确定其病原,对采集的发病猪肺脏样品进行了细菌分离、生化试验、PCR检测、药敏试验、动物致病性试验等。结果表明,从该规模养猪场分离获得1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,经生物学特性分析、PCR检测鉴定为APP生物Ⅰ型、血清型1型。致病性试验结果显示该分离株对小鼠具有致病性,药敏试验显示该菌株对环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等喹诺酮类药物具有敏感性。经耐药基因检测分析,该病原为携带floR耐药基因的血清型1型猪胸膜肺炎放线杆菌。

动物源性沙门氏菌的耐药性分析及氟苯尼考类耐药基因的鉴定

为了解动物沙门氏菌的流行情况和药物敏感性及氟苯尼考耐药株的耐药基因分布,本试验对临床上疑似患沙门氏菌病的病料进行病原分离和细菌的多重PCR鉴定;采用K-B法测定分离株对23种抗菌药物的敏感性;选择氟苯尼考耐药菌株扩增floR、fexA、fexB、cfr和pexA基因。结果显示,共鉴定出61株沙门氏菌,其中肠炎沙门氏菌10株,鸡白痢沙门氏菌12株,鼠伤寒沙门氏菌39株。所有菌株对青霉素、红霉素、万古霉素耐药,90.16%对6种及6种以上抗菌药耐药。floR基因广泛存在于鼠伤寒沙门氏菌氟苯尼考耐药菌株中(8/12,66.67%),未发现其他耐药基因。研究结果表明鼠伤寒沙门氏菌是鹅源分离株中的优势血清型;floR基因主要介导沙门氏菌对氟苯尼考耐药性,但可能还存在其他机制。

圈养虎源大肠杆菌中氯霉素类药物耐药基因的调查

采用K—B法检测30株虎源大肠杆菌对氯霉素类药物的耐药性。根据耐药表型和耐药基因的流行情况,指导临床合理用药。结果表明:30株虎源大肠杆菌对氯霉素的耐药率为85%,对氟苯尼考的耐药率为78%。cmlA基因的阳性率为70%,floR基因的阳性率为23.3%。

海参、海胆养殖水体中多抗性细菌抗性基因的初步研究

抗药性细菌对生态环境、养殖业以及人类健康构成严重威胁。以大连海参、海胆养殖场多抗性细菌筛选为基础,采用分子生物学手段对40株抗性细菌进行了氯霉素、土霉素及氟氯霉素抗性基因检测,探讨抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础。

益生菌治疗结肠炎大鼠前后肠道菌群变化及毒力因子检测分析

目的研究服用益生菌VSL#3前后,结肠炎(UC)大鼠肠道菌群的变化以及6种常见细菌毒素基因携带率的改变,同时探究益生菌的最适治疗浓度。方法 5%硫酸葡聚糖钠(DSS)溶液自由饮用一周,构建结肠炎大鼠模型,观察和评价大肠黏膜的组织学损伤,计算DAI评分以及病理学评分。收集各组Sprague-Dawly大鼠(SD大鼠)的粪便标本,通过粪便涂片革兰染色镜检法和细菌培养鉴定进行菌群分析,利用实时荧光定量PCR检测粪便中6种常见细菌的毒素基因。结果益生菌治疗组DAI评分、病理学评分均低于模型组(P<0.05);益生菌治疗组菌群失调程度较DSS造模组减轻(P<0.05),需氧和厌氧条件致病菌的优势生长率均低于DSS组;益生菌治疗后各个小组中多种致病菌毒素基因的总携带率较DSS组降低,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。不同浓度益生菌治疗组之间,菌群失调程度,需氧条件致病菌和厌氧条件致病菌的优势生长率,致病菌毒素基因携带率,均无显著性差异(P>0.05),其中中浓度治疗组涂片菌群失调率以及失调程度积分最低。结论益生菌可能通过改善结肠炎大鼠肠道菌群失调情况、降低肠道细菌毒素基因的携带率,从而发挥其对溃疡性结肠炎的治疗作用;中浓度[0.6g/(kg·d)]的益生菌可能是治疗溃疡性结肠炎的最适浓度。

海参、海胆养殖水体中多抗性细菌抗性基因的筛选

由于抗生素药物的大量使用和相当程度的滥用,使得水产病原菌耐药性十分严重,多重药物抗性细菌也时有发生,大大增加了微生物病害防治的难度。为探讨抗性细菌的抗药性分子遗传机理,从而为控制抗药性细菌的产生和传播提供研究基础,本研究以大连海参、海胆养殖水体多抗性细菌筛选为基础,利用分子生物学方法对这些抗性细菌进行了土霉素、氯霉素及氟氯霉素抗性基因的筛选。研究发现,大部分耐药细菌都携带多种抗性基因,证明它们的耐药性都是由相应抗性基因决定的。

鱼源嗜水气单胞菌对氟苯尼考的耐药性分析

为阐明淡水鱼的主要致病菌嗜水气单胞菌对氟苯尼考的耐药现状，本试验采用纸片扩散法和浓度稀释法分别定性、定量检测了2010年9月至2013年5月期间收集的26株鱼源嗜水气单胞菌对氟苯尼考的耐药性，利用PCR法检测菌株携带氟苯尼考耐药基因的情况。结果显示，北京地区的鱼源嗜水气单胞菌对氟苯尼考的耐药率为15．38％，氟苯尼考对其最小抑菌浓度（MIC）主要集中在2～4μg／mL，5株菌对氟苯尼考的MIC超过8μg／mL，1株分离菌具有氟苯尼考耐药基因floR。结合以往数据及其他省市的相关数据，结果表明鱼源嗜水气单胞菌对氟苯尼考已呈较高的耐药率和耐药浓度，且位于质粒上的floR基因阳性菌株有传递该基因给其他种属鱼类致病菌的风险。因此，有必要科学规范氟苯尼考在水产养殖中的应用。

猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测试剂盒的研制

根据Gen Bank中猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的序列设计1对特异性引物,扩增出floR基因片段,克隆到p MD-18T载体上,构建p MD-18T-floR阳性标准质粒。通过SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件的优化、荧光定量PCR标准曲线的建立、熔解曲线的分析及敏感性、特异性、重复性试验,建立针对猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的荧光定量PCR检测方法,并研制出检测试剂盒,同时对从养殖场分离的156株大肠杆菌进行耐药表型和耐药基因检测。结果显示,研制的试剂盒灵敏度可达1.0×101拷贝,重复性好,特异性强,对大肠杆菌磺胺类耐药菌株、β-内酰胺类耐药菌株、大环内酯类耐药菌株检测均为阴性,熔解曲线分析,扩增产物的熔解温度为88.8~89.2℃,没有引物二聚体和非特异性扩增峰出现,耐药表型与耐药基因检测符合率为96.7%。表明研制的试剂盒适合于临床样品猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因的检测。

禽源多杀性巴氏杆菌耐药性分析及氟苯尼考耐药基因floR分布

为了解禽源多杀性巴氏杆菌的药物敏感性及氟苯尼考的耐药基因的分布特征,采用琼脂二倍稀释法,对分离自福建、广东和江西等南方数省部分地区113株禽源多杀性巴氏杆菌进行9种抗生素的耐药性分析,并应用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR的分布情况。结果显示:上述菌株对四环素表现高水平耐药,耐药率为65.49%(74/113);对链霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、氟苯尼考、卡那霉素与恩诺沙星表现中等水平耐药,耐药率分别是43.36%(49/113)、39.82%(45/113)、27.43%(31/113)、25.66%(29/113)与24.78%(28/113);对氨苄西林、头孢噻呋与头孢克洛较为敏感,耐药率分别为4.42%(5/113),2.65%(3/113)与1.77%(2/113);其中52.21%(59/113)菌株能耐受3类及3类以上的抗菌药物;氟苯尼考耐药基因floR的检出率为64.04%(72/113),且所有氟苯尼考耐药菌株均含有floR基因。结论:113株禽源多杀性巴氏杆菌存在多重耐药现象,且floR耐药基因较为流行。本研究结果为上述地区针对禽源多杀性巴氏杆菌临床用药提供科学依据。

保定地区不同动物源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因flor的同源性分析

为了解不同动物间大肠杆菌的耐药性,对分离的23株鸡源、14株猪源和8株牛源大肠杆菌进行了耐药性测定,并对其氟苯尼考耐药基因flor进行了同源性分析。结果显示,同种动物之间、猪源与牛源flor基因的相似性为100%,鸡源与猪源、牛源flor基因的相似性为99.8%。与GenBank中已报道的flor基因(登录号AF231986)进行比对,鸡源flor基因在开放阅读框的第439,479,683位出现点突变,猪源、牛源flor基因在开放阅读框的第439,683,1100位出现点突变。由flor基因编码的氨基酸序列也发生了相应的改变。