重组牙鲆MRF4在大肠杆菌中的表达、纯化及多克隆抗体分析(英文)

MRF4 是肌肉发生调节因子家族的一员,其对肌肉的发育有重要的调节作用. 对于养殖鱼类,生长速度是很重要的经济指标,而肌肉的发育对鱼类的生长非常重要. 制备了 MRF4 的多克隆抗体以分析在鱼类中 MRF4 的功能. 通过采用大肠杆菌表达系统及 pET-30 表达载体对牙鲆肌肉发生调节因子 MRF4 进行了体外重组表达. 所得到的 MRF4 重组蛋白为可溶性的. 在自然条件下,经金属离子螯合柱纯化后,得到了电泳纯的融合蛋白,通过免疫新西兰大白兔制备 MRF4 的多克隆抗体. 蛋白质印迹分析显示:重组蛋白能被抗组氨酸标签的抗体及所制备的多克隆抗体识别,而且这一多克隆抗体能检测到内源性的 MRF4 蛋白,从而进一步证明了抗血清中含有 MRF4 的抗体. MRF4 融合蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步深入研究其在牙鲆肌肉发育过程中的分子机制奠定了基础.

一个新的高保守自身免疫反应相关分子IRF-4结合蛋白多克隆抗体制备

目的获得一个新的高保守自身免疫反应相关分子IRF-4结合蛋白（IRF-4-binding protein，IBP）的高效价特异性多克隆抗体。方法通过生物信息学分析选择IBP特异片段（1228～1893bp），目的片段cDNA插入pET32a和pGEX-KG原核表达载体，分别转化BL21感受态细菌，IPTG诱导表达后组合应用阴离子交换层析、His、GST亲和层析技术获得免疫原（pET32a／IBP融合蛋白）及检测原（pGEX-KG／IBP融合蛋白）。HPLC鉴定纯度。利用改良快速免疫法获得兔抗IBP多克隆抗血清，并经蛋白A柱纯化，非特异性抗体吸收。间接ELISA检测抗体滴度、Western blot和免疫组化实验检测抗体特异性。结果表达并纯化的pET32a／IBP融合蛋白纯度达92％，pGEX-KG／IBP融合蛋白纯度达87％。IBP多克隆抗体滴度达1：51200，能特异地和内源性IBP结合。结论成功表达并纯化了IBP融合蛋白，制备了高滴度、高特异性的抗IBP多克隆抗体。

MORF4L1蛋白抗体制备及生物信息学分析

[目的]构建MORF4L1原核表达载体和纯化表达产物,制备MORF4L1蛋白抗体并进行生物信息学分析。[方法]利用PCR将MORF4L1基因片段酶切、克隆、转化至大肠杆菌Bl21(DE3),经IPTG诱导表达蛋白。利用His-Tag技术纯化重组蛋白,用重组蛋白免疫新西兰白兔,采集抗血清后通过硫酸铵沉淀法将多克隆抗体从抗血清中纯化,应用Western Blotting验证多克隆抗体与内外源性MORF4L1蛋白的结合特异性。利用在线软件(GEPIA、UALCAN)进行生物信息学分析。[结果]成功构建了重组蛋白,蛋白纯化后在相对分子质量(Mr)43000位置处有单一条带,重组His-MORF4L1蛋白与His抗体发生特异性结合。制备的抗血清与MORF4L1蛋白特异性结合,纯化后仅在相对分子质量(Mr)55000和25000位置处有条带。纯化的多克隆抗体与内外源性MORF4L1蛋白发生特异性反应。MORF4L1的表达与肝癌不良预后相关。[结论]成功构建MORF4L1蛋白及抗体,MORF4L1在肝癌中高表达预后差,对进一步研究MORF4L1蛋白的结构和生物学功能具有重要意义。

人视黄醇结合蛋白4在杆状病毒系统中的表达及其多克隆抗体制备

旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(RBP4)并检测其免疫原性。将人RBP4基因片段及信号肽SS64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-dual(pFBd)中,获得相应的重组转移质粒;转化大肠杆菌菌株DH10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的Sf9细胞,获得含人RBP4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的Sf9细胞并表达人RBP4蛋白(I-RBP4),通过SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的Sf9细胞制备一批RBP4蛋白,完成SDS、Western blotting的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与E.coli重组人RBP4(E-RBP4)分别免疫家兔。实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确;成功构建重组RBP4-bacmid;人RBP4蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的RBP4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23 kDa,经过计算表达量为100 mg/L;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100 000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10 000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的RBP4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血RBP4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础。