应用Ca^(2+)荧光探针fluo-3和fluo-4测定H_2O_2诱导的A549细胞凋亡过程中的[Ca^(2+)]_i变化

背景与目的肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤,Ca2+对于肿瘤细胞凋亡有重要的调控作用。实时监测肺癌细胞内Ca2+水平,有助于深入研究Ca2+介导肺癌细胞凋亡的分子机制。本研究旨在观察Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4在H2O2诱导的A549细胞凋亡过程中的应用,实时测定胞浆Ca2+浓度([Ca2+]i),探讨[Ca2+]i与细胞凋亡的关系,并比较两种Ca2+探针在荧光强度及[Ca2+]i测定值方面的差异。方法采用Ca2+荧光探针fluo-3和fluo-4负载细胞,1 h后用不同浓度的H2O2刺激细胞,激光扫描共聚焦显微镜实时测定选取细胞的[Ca2+]i变化。采用DAPI染色试剂盒观察H2O2刺激后细胞凋亡情况。结果在相同的探针浓度、负载时间和相同的图像采集参数的条件下,选定细胞内fluo-4平均荧光强度高于fluo-3。50 mM H2O2刺激后,A549细胞胞浆内[Ca2+]i迅速升高,通过公式计算发现采用fluo-3探针负载的选定细胞中[Ca2+]i变化范围是112.2 nM-1,069.6 nM,采用fluo-4探针负载的选定细胞中[Ca2+]i变化范围是7.6nM-505.4 nM。同时发现经H2O2刺激后,凋亡细胞百分比明显增加(P<0.01)。结论 H2O2促进A549细胞内Ca2+释放,诱导细胞凋亡。Ca2+探针fluo-4可能更适合于监测含量较低的细胞中[Ca2+]i变化。

利用荧光探针Fluo-4检测胸腺细胞内钙离子浓度变化

利用荧光显微数码成像系统测量荧光探针Fluo-4荧光强度的改变,建立动态检测细胞内钙离子浓度的方法。用荧光探针Fluo-4/AM标记原代培养小鼠胸腺细胞,以KCL刺激胸腺细胞去极化,并打开细胞膜上电压依赖性钙通道,细胞内荧光强度会发生改变。利用荧光显微数码成像系统动态监测Fluo-4荧光强度的改变可分析计算钙离子浓度。本方法灵敏度高,能实时监测细胞内钙离子浓度的变化。

siRNA沉默P_2X_4表达对永生化小鼠小胶质细胞活化的抑制效应

目的:探讨特异性P2X4 siRNA对永生化小鼠小胶质细胞活化的抑制效果.方法:体外培养永生化小鼠小胶质细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组、转染siRNA-F1组.空白对照组未进行任何干预;阴性对照组转染Ncontrol siRNA;转染siRNA-F1组转染先前筛选出来的1条特异性siRNA.3组细胞分别用50μmol/LATP刺激,采用激光扫描共聚焦显微镜检测胞内钙离子浓度([Ca2+]i);P2X4R/OX42免疫荧光双标染色观察细胞形态.结果:转染siRNA-F1组ATP活化小胶质细胞后,胞内钙离子释放较阴性对照组和空白对照组减少;P2X4R/OX42免疫荧光双标染色显示转染siRNA-F1组细胞存在活化态小胶质细胞和静息态小胶质细胞,而空白对照组和阴性对照组只存在活化态小胶质细胞.结论:siRNA-F1能部分抑制永生化小鼠小胶质细胞的活化.

姜黄素对BGC-823及MCF-7细胞内钙离子信号波动的研究

研究姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的可能机制 ,利用 fluo-4/AM荧光钙离子探针测定 BGC-82 3细胞与MCF-7细胞经姜黄素处理后的钙波变化 ,以及 BGC-82 3细胞经姜黄素处理后细胞内钙分布的变化。结果表明姜黄素可引起细胞内钙库的动员和钙离子的释放。提示

哇巴因对心肌细胞钙瞬变及收缩力的作用

目的检测哇巴因对正常大鼠和阿霉素所致心衰大鼠左心室肌细胞的收缩力、钙瞬变和舒张期钙影响。方法腹腔注射阿霉素制备大鼠心衰模型,以改良的Langendorff装置分离心肌细胞,负载Fluo-4钙荧光染料后采用IonOptix可视化细胞动缘探测系统检测哇巴因对大鼠心肌细胞收缩功能、舒张期钙及钙瞬变的变化。结果哇巴因可浓度依赖性增加正常大鼠心肌细胞收缩力和钙瞬变,3×10-7 mol·L-1哇巴因即明显增加收缩力和钙瞬变,但对心衰大鼠心肌细胞,1×10-5 mol·L-1哇巴因才明显增加心肌细胞收缩力和钙瞬变;哇巴因也可增加正常大鼠和心衰大鼠心肌细胞舒张期钙。结论哇巴因能够增加心肌细胞收缩力、钙瞬变和舒张期钙,阿霉素所致心衰大鼠心肌细胞较正常细胞不敏感。

IGF-1诱导心肌细胞钙动员的机制研究

以F luo-4-AM标记心肌细胞,采用激光共聚焦显微技术,测定和分析了IGF-1诱导单个心肌细胞胞质、胞核游离Ca2+浓度的动态变化,初步探讨了其作用机制。

GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像研究

目的研究GCa MP(属于基因编码钙指示剂/蛋白钙指示剂)基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像。方法用慢病毒转染C17.2细胞,获得稳定表达GCa MP基因的C17.2-GCa MP细胞。Real-time PCR定量检测C17.2细胞及C17.2-GCa MP细胞中神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)的表达情况。将C17.2细胞(Fluo-4 AM染色后)和C17.2-GCa MP细胞置于定制数字荧光显微镜下进行钙离子荧光检测。结果 Real-time PCR检测结果提示C17.2细胞及C17.2-GCa MP细胞中nestin表达差异无统计学意义(P>0.05)。C17.2-GCa MP细胞较Fluo-4 AM染色C17.2细胞钙离子荧光锐波(spike)波形持续时间长且相对荧光强度强(P<0.05),在Fluo-4 AM染色C17.2细胞中能观察到钙离子荧光慢波(wave)波形,而C17.2-GCa MP wave波形不典型。结论 C17.2-GCa MP细胞在保持神经干细胞干性的同时能够监测细胞内钙离子变化,能够运用于神经干细胞移植治疗视网膜色素变性功能整合的研究。

基于RBL-2H3与P815细胞体外模型的聚山梨酯80、维生素K_(1)注射剂、注射用两性霉素B脂质体类过敏反应潜在风险评价

目的基于RBL-2H3及P815细胞系,选择Compound 48/80(C48/80)为阳性药构建类过敏反应的体外评价模型,初步评价聚山梨酯80、维生素K_(1)注射剂(VK_(1)I)、注射用两性霉素B脂质体(ABL)导致类过敏反应的潜在风险。方法应用CCK-8法检测C48/80(10、30、60、100μg·mL^(−1))、聚山梨酯80(2.5、5.0、10.0、50.0 mg·mL^(−1))、VK_(1)I(0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg·mL^(−1))、ABL(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg·mL^(−1))对RBL-2H3、P815细胞活性的影响,计算半数抑制浓度(IC50),阳性药及受试物均选择<IC50浓度进行后续实验;结合中性红染色形态学观察,研究阳性药及受试物的细胞毒性;流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞率及Fluo-4AM标记率;ELISA法检测β-氨基己糖苷酶(β-Hex)及组胺释放量。结果中性红染色结果显示,在C48/80作用下RBL-2H3、P815细胞部分皱缩或者偶有破损,但大部分细胞仍维持完整细胞形态;在聚山梨酯80、ABL、VK_(1)I高浓度的作用下,RBL-2H3、P815细胞大部分仍能保持正常形态。C48/80在<IC50浓度时能够引起较强的细胞脱颗粒反应,模型建立成功。聚山梨酯80、VK_(1)I在<IC50浓度时均出现了浓度相关性细胞脱颗粒现象,与对照组比较,2种细胞聚山梨酯802.5、5.0 mg·mL^(−1)组及VK_(1)I 0.75、1.50、3.00 mg·mL^(−1)组Annexin V阳性率、Fluo-4AM标记率均显著升高(P<0.05、0.01);聚山梨酯802.5、5.0 mg·mL^(−1)组及VK_(1)I 1.5、3.0 mg·mL^(−1)组的组胺、β-Hex释放量显著升高(P<0.05、0.01)。ABL组Annexin V阳性率浓度相关性升高趋势不明显,与对照组比较,仅P815细胞ABL 2.00 mg·mL^(−1)组显著升高(P<0.05),且升高幅度不大;与对照组比较,2种细胞ABL 1、2 mg·mL^(−1)组的Fluo-4AM标记率和组胺、β-Hex释放量显著升高(P<0.05、0.01)。结论聚山梨酯80、VK_(1)I高浓度具有导致类过敏反应产生风险,ABL还需进一步研究。

脉冲磁场处理对格氏李斯特菌钙离子跨膜行为的影响

研究了脉冲磁场处理后格氏李斯特菌细胞Ca^(2+)的跨膜行为,包括对该探针进行荧光光谱特性以及细胞负载研究,建立了格氏李斯特菌胞内钙离子荧光强度测定方法,同时采用激光共聚焦荧光显微镜检测不同脉冲数下受脉冲磁场处理的后格氏李斯特菌胞内钙离子荧光强度和浓度的变化。研究结果表明,Fluo-4/AM荧光探针自身的荧光强度较小,能成功负载于格氏李斯特菌中,可用于格氏李斯特菌胞内游离Ca^(2+)浓度的测定,且最优负载条件是负载浓度6μmol/L,负载时间60 min,负载温度37℃。经不同脉冲数的脉冲磁场处理后,格氏李斯特菌胞内Ca^(2+)浓度与菌落总数的变化呈较高的负相关性;LCSM观察发现,在一定脉冲数范围,胞内Ca^(2+)荧光强度随脉冲数的增加而增加,这说明脉冲磁场作用造成细胞生物膜通透性改变,使胞外大量Ca^(2+)跨膜进入胞内。由此推测,由脉冲磁场造成的细胞生物膜通透性的变化,导致胞内Ca^(2+)浓度的升高,这是脉冲磁场具有杀菌作用的重要原因。