建立检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2的mRNA相对表达水平的RT-qPCR方法

目的本研究旨在建立一种实时荧光定量PCR方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平。方法使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)的ABCG2核苷酸序列号NM_001032919.1及内参GAPDH核苷酸序列号NM_001195426.1,借助Primer premier 5.0软件设计PCR引物。提取猕猴新鲜肾组织的总RNA,并反转录合成cDNA。接着,利用PCR引物进行实时荧光定量PCR扩增,并根据反应体系中荧光的变化情况定量分析ABCG2的mRNA相对表达水平。结果PCR产物测序结果显示,扩增的ABCG2和GAPDH核苷酸序列与NCBI上猕猴的序列同源性分别为90.91%和91.14%。ABCG2和GAPDH的扩增效率均达到80%~120%,实时荧光定量PCR标准曲线的熔解曲线为单峰,R2接近1。结论本研究建立的检测猕猴ABCG2 mRNA实时荧光定量检测方法,为研究高尿酸血症的发病机制以及新药开发奠定基础。

基于核酸适配体的SYBR Green I qPCR法检测鳗弧菌(Vibrio anguillarum)

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)可感染鲈鱼、鳗鲡等多种水产养殖动物,是水产养殖中的重要病原菌,对其进行快速检测是病害防控的基础。利用鳗弧菌与其核酸适配体间较强的亲和特异性,通过核酸适配体来识别、结合鳗弧菌,然后以结合的核酸适配体为模板,进行SYBR Green I实时荧光定量PCR(qPCR)扩增,通过Ct值来定量检测鳗弧菌的浓度,从而建立了鳗弧菌的适配体-qPCR定量检测方法。从特异性、标准曲线、灵敏度、重复性和应用效果对该方法进行分析,表明该方法具有很强的特异性,能特异性地扩增鳗弧菌,且对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、变形假单胞菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌均无扩增;在10^(3)~10^(11) CFU/L的检测范围内有较好的线性关系,可用于鳗弧菌的定量检测;同时,该方法有较高的灵敏度和稳定性,其最低检测限为10^(3) CFU/L,组内和组间变异系数分别小于0.17%和1.98%;最后采用该方法对鱼体组织样品进行了应用检测,证明了该方法具有较好的可行性和应用性,可用于水产品或食品中鳗弧菌的定量检测。

基于主成分分析的多重定量PCR荧光串扰校正

聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学常用的检测手段,主要用于对生物的DNA或RNA进行检测。由于荧光光谱重叠和滤光片过滤带宽限制,检测时所获得的荧光数据通常会包含荧光通道之间的串扰,串扰的存在使PCR结果分析变得复杂,并可能影响最终的检测结果。选择合适的光学元件,并确定通道间的补偿矩阵,可以降低甚至消除荧光串扰。目前荧光补偿矩阵大多通过迭代计算获得,还没有一种简单的方法可以从混合的多通道荧光数据中找到荧光补偿矩阵。为了快速获得荧光补偿矩阵,减小计算量,采用主成分分析法(PCA)中确定主成分的方式,基于搭建的测试平台进行单一染料实验,获得染料的荧光信号在各个检测通道的分布情况,计算得到荧光补偿矩阵。通过分析补偿矩阵,发现对于搭建的硬件系统,Cy5染料对Cy5.5通道串扰较大,串扰比例为8.76%,同时Cy5.5染料对Cy5通道串扰影响也相对较大,比例约为6.2%;其次是ROX染料对HEX通道串扰,比例约为2.68%;HEX染料对FAM通道串扰,比例约为1.58%;FAM染料对HEX通道串扰相对较小,比例约为0.25%,其余通道无明显串扰,与荧光光谱反映的结果一致。采用得到的荧光补偿矩阵对单一染料实验得到的原始荧光数据进行处理,有效去除了非目标通道的荧光串扰,实现了荧光通道数据的解耦,验证了方法的可行性。最后设计了染料颜色分辨实验,将不同浓度的多种染料进行组合测试,并采用所提出的方法将得到的数据进行荧光补偿。实验结果表明,荧光通道各自的线性相关性较高,五个荧光通道的线性相关系数r均大于0.99,该结果进一步验证了该补偿方法的有效性。

5种猪源消化道传播病原体荧光定量PCR检测方法的建立

猪源人兽共患病不仅威胁公共卫生安全,还威胁生猪养殖业的健康发展;其中消化道传播是其主要的传播途径。为及时鉴定出经消化道传播的病原体,本试验建立了猪源大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌和志贺菌的四重荧光定量PCR和戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法,并优化反应体系和条件,实现5种病原体的同时检测;并利用荧光定量PCR与普通PCR对117份猪临床样品(病变组织、粪便和肌肉等)进行对比检测。结果显示,建立的荧光定量PCR能够在1.5 h内完成对大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒5种病原体的特异性检测,与其他常见细菌和病毒无交叉反应,检测极限值可达5个拷贝,标准曲线相关系数均不低于0.997,线性范围涵盖1×10^(1)~1×10^(9),批内和批间变异系数(CV)均低于3.16%。建立的荧光定量PCR与普通PCR方法检测结果的符合率达到95.73%~100%,具有较好的一致性。117份临床样品中大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒各自的阳性率分别为31.62%、17.95%、6.84%、5.13%和11.11%。结果表明,本试验所建立的荧光定量PCR方法灵敏、特异、稳定,能够同时、快速区分检测上述5种猪源消化道传播病原体,可为猪肉制品从产地到餐桌全环节样品的监测提供有力的技术支持。

荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用效果

目的探讨荧光定量PCR(QF-PCR)技术联合染色体核型分析在产前诊断中的应用效果。方法选取2022年9月至2023年5月于惠州市第二妇幼保健院产前诊断中心行羊水穿刺检查的388例孕中期孕妇为研究对象,所有入选者均进行染色体核型分析、QF-PCR技术检查。以染色体核型分析为标准,分析QF-PCR技术在产前诊断中的应用价值。结果388例受检羊水中,QF-PCR检测出其中1例母血污染。388例受检者中QF-PCR共检出17例染色体非整倍体异常,包括21三体异常10例,18三体异常2例,13三体异常1例,性染色体异常4例。与染色体核型分析结果相符,染色体核型分析结构异常13例,QF-PCR技术均未检出。结论QF-PCR技术能鉴别母血污染以及检查快速,可弥补染色体核型分析时间长的不足;而染色体核型分析可补充QF-PCR技术对其他染色体异常检测的不足,两种方法联合使用可起互补作用,利于减少出生缺陷。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

牛呼吸疾病综合征七病原联合检测多重qPCR方法的建立

为了提高牛呼吸疾病综合征多病原混合感染的临床诊断效率,以牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)oppD/F基因、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.m)ompH基因、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,M.h)gcp基因、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gB基因、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)以及牛副流感病毒(bovine parainfluenza virus type,BPIV) 3型a和c基因型(BPIV-3a,-3c)的N基因等为检测靶标,分别设计特异性引物和Taqman探针,通过优化反应条件,采用3管7联的组合方式建立了7种病原体的多联实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法仅对本试验的7种病原有特异性反应,与其他常见病原无交叉反应。对M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c质粒标准品的最低检测限分别为102、102、101、102、102、102和101拷贝/μL。组内变异系数小于2.5%,组间变异系数小于5.5%。平行应用该方法和常规PCR方法对临床采集的115份有呼吸道症状牛的鼻拭子进行检测,P.m阳性率36.65%,M.b阳性率27.83%,M.h阳性率25.22%,IBRV阳性率11.30%,BPIV-3c阳性率8.57%,BRSV阳性率0.95%;其中混合感染率为26.1%。共检测到11种混合感染模式,主要由M.b与其他病原体的混合感染,占72.7%(8/11);M.b/P.m混合感染的检出率最高,占60%(18/30);M.b、P.m、M.h在混合感染中出现率排前三,其占比分别为73.3%(22/30)、73.3%(22/30)和43.3%(13/30);其次为IBRV,占26.7%(8/30);BPIV-3c占13.3%(4/30)。以上结果表明,该方法具有较高的分析敏感性和特异性,可用于牛呼吸疾病综合征多病原感染的联合检测。

食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌实时荧光PCR检测的研究

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的核酸检测方法。方法:根据16S~23S rRNA基因片段序列,利用Oligo7设计TaqMan探针及引物,并验证实时荧光PCR检测方法的特异性和灵敏性。结果:用实时荧光PCR检测方法检测15株标准菌株,只有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌呈阳性,验证了此方法具有良好的特异性。灵敏度实验中得出菌液灵敏度为5.8×10~2 CFU·mL^(-1),DNA灵敏度为7.2×10^(-4) ng·μL^(-1)。结论:建立的实时荧光PCR检测方法有良好的特异性和灵敏度,该方法可用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测,具有较好的应用价值。

荧光定量PCR法与培养法检测解脲支原体结果比对分析

目的通过比较荧光定量PCR法(qPCR)和培养法在解脲支原体(UU)检测中的符合率,为临床解脲支原体检测方法的选择提供参考依据。方法收集近期就诊于该院112例患者的生殖道分泌物标本,分别采用qPCR法与培养法检测UU。结果在112例标本中,UU培养法阳性53例,阳性率为47.32%,qPCR法阳性61例,阳性率54.46%(χ2=1.143,P=0.285>0.05)。61例qPCR法阳性的UU浓度范围1.60×10^(3)-1.04×10^(7)copy/mL,其中10^(3)copy/mL 12例(19.7%),10^(4)copy/mL 15例(24.6%),10^(5)copy/mL 22例(36.1%),10^(6)copy/mL 9例(14.7%),10^(7)copy/mL 3例(4.9%)。培养法阴性而qPCR法阳性病例9例,qPCR法测定浓度范围10^(3)~10^(5)copy/mL。结论qPCR法检测UU的阳性率略高于培养法,两种方法不符合结果的UU测定浓度分布在10^(3)-10^(5)copy/mL之间。

猫冠状病毒荧光定量PCR检测方法的建立

猫冠状病毒(FCoV)在全球猫种群中广泛流行,隐形感染的猫导致病毒在猫群中持续传播。提高样本检测率、早预防、早治疗可减少种群中病毒流行率。为建立可以灵敏、准确检测FCoV的Taq Man荧光定量PCR检测方法,根据GenBank公布的FCoV基因片段N保守区域设计了1对特异性引物和1条探针,通过优化反应体系,建立了FCoV Taq Man荧光定量PCR检测方法,对75份临床样品进行检测。结果表明,该方法在1.49×10^(11)~1.49×10^(2) copies/μL之间具有良好的线性关系,特异性强,敏感性高,对FCoV质粒标准品最低检测下限为1.49×10^(0) copies/μL,而普通PCR对FCoV质粒标准品最低检测下限为1.49×10^(5) copies/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%;75份临床样品,阳性率为37.33%。研究建立的FCoV检测方法扩增效率高、特异性强、敏感性好、稳定性高,且实用性好,可以用于FCoV的快速检测,可为流行病学调查提供有效的技术手段。

数字PCR和荧光定量PCR检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数方法的建立及其应用

传统的检测转基因植物中外源基因拷贝数的方法是Southern杂交,该方法成本高、周期长,难以满足高通量检测外源基因拷贝数的育种需求,因此,本研究旨在建立快速且高通量检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。本研究从番木瓜基因组中筛选出2个单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770,以已知外源基因为单拷贝整合的转基因番木瓜为参照,利用数字PCR鉴定其拷贝数,进一步以其为内参基因,以番木瓜转基因育种常用的筛选标记基因NPTⅡ为外源目的基因,建立利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法。结果表明:Cpa03g018830和Cpa03g018770均为单拷贝基因;建立的数字PCR方法对转基因番木瓜中的外源基因拷贝数的检测准确可靠,而荧光定量PCR对转基因番木瓜中外源基因单低拷贝整合的检测准确度较高,对外源基因多拷贝整合的检测准确度则较低,因此,荧光定量PCR适合用来在大量转基因植株中初筛出单低拷贝整合的植株。本研究鉴定的单拷贝基因Cpa03g018830和Cpa03g018770可作为转基因番木瓜中外源基因拷贝数检测的内参基因,且建立的利用数字PCR和荧光定量PCR技术检测转基因番木瓜中外源基因拷贝数的方法,操作简单,速度快,适合批量检测,可为番木瓜转基因抗病育种中单低拷贝株系的选育提供新的方法。

齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立

【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数为130;大田兰花样品感染齿兰环斑病毒的检出率为100%。【结论】一步法RT-qPCR是一种特异性强、灵敏度高,且适合监测实际生产过程中兰花感染齿兰环斑病毒情况的检测方法。

花生制品中金黄色葡萄球菌SYBR Green qPCR快检方法的评价研究

金黄色葡萄球菌是花生及其制品中常见的一种食源性致病菌,针对金黄色葡萄球菌的快速检测方法对实现花生及其制品中的食品安全防控有重要意义.根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)设计了3对特异性引物,同时优化了退火温度,成功建立了一种特异性引物的SYBR Green实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法,进一步对该方法的特异性、重现性及灵敏度进行了验证.以8种模拟污染花生加工产品为实验对象,对该方法与荧光定量PCR试剂盒-探针法及商品化Baird-Parker干粉培养基法进行了评价研究.结果表明,建立的SYBR Green qPCR快速检测方法特异性和重现性良好,最低检测限为8.99 copies/μL,其灵敏度比荧光定量PCR试剂盒-探针法高2个数量级.SYBR Green qPCR快速检测方法具有成本低、检测快速、特异性好、灵敏度高的优点,可用于花生及其制品中金黄色葡萄球菌的快速检测,也可为防控其他食品中的金黄色葡萄球菌污染提供参考.

荧光定量PCR法检测ABL1激酶区突变

目的:建立一种敏感性高且能定量分析ABL1激酶区突变的检测方法,为慢性髓系白血病(CML)的早期诊断和治疗提供有力支持。方法:收集35例经Sanger测序法检测为阴性的CML患者剩余标本。ABL1激酶区突变检测采用上海源奇生物医药科技有限公司的突变检测试剂盒采用^(△△)Ct值法分析突变率通过计算突变率并除以融合基因表达量,得出ABL1激酶区的相对突变率。结果:在35例经Sanger测序法检测为阴性患者中重新采用荧光定量PCR法检测ABL1激酶区突变,有7例出现T315I突变2例T315A突变2例Y253H突变,1例E255K突变,其相对突变率在0.1%-19.42%之间,均属于低频突变,超出了Sanger测序法的检测范围。随后应用该方法对126例CML患者进行ABL1突变检测与Sanger测序法相比,该方法的阳性率提高,显示出更高的敏感性。针对患者的突变情况进行相应的临床治疗调整后,观察到患者BCR-ABL1融合基因表达显著性下降或转为阴性。结论:与Sanger测序法相比,荧光定量PCR法在检测ABL1激酶区突变方面具有更高敏感性,能早期筛选出低频ABL1激酶区突变,并进行相对定量分析,该方法具有较好的临床应用前景。

猫冠状病毒和猫细小病毒双重荧光定量PCR方法的建立

为建立猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)和猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的双重荧光定量PCR方法,选取FCoV 3'UTR和FPV VP2基因保守区域,分别设计2对特异性引物和TaqMan MGB探针,并进行反应体系和条件优化,以及特异性、敏感性和重复性试验,探讨所建方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FCoV和FPV,与猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫轮状病毒、支原体、衣原体、波氏杆菌、犬腺病毒和犬副流感病毒等病原核酸无交叉反应,对FCoV和FPV检测限均为1 copies/μL;FCoV和FPV阳性参考质粒组间和组内重复试验变异系数均小于3%;对35份临床样本进行检测,发现建立的双重荧光定量PCR方法阳性检出率比普通PCR方法高。结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有灵敏、特异和稳定等优点,可用于临床FCoV和FPV感染的早期鉴别诊断。

猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

鸽腺病毒通用型实时荧光PCR检测方法的建立与应用

鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAdV)是影响鸽产业健康发展的重要病原之一。为实现PiAdV的高通量快速检测,根据GeneBank登录的PiAdV-A种和PiAdV-B种病毒pⅧ基因序列的共同保守区域设计特异性检测引物和探针,经反应条件优化,建立了一种PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示:该方法的最佳探针浓度为0.2μmol/L,与鸽群其他常见病毒无交叉反应,对PiAdV的最低检测限为56.9 copies/μL,比常规PCR敏感性高100倍,组内和组间重复变异系数均小于1.8%。利用该方法和常规PCR方法对20份疑似PiAdV感染样品进行检测,发现PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法的病毒阳性检出率高于常规PCR方法。结果表明,本研究建立的PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法特异性强、敏感性高、可靠性好,可用于PiAdV感染的临床检测及流行病学调查。