金黄色葡萄球菌fnbA和fnbB基因及fnbAB双基因缺失突变体菌株的构建

目的 构建纤维连接蛋白结合蛋白 （ FnbP）基因fnbA、fnbB及fnbAB基因敲除质粒并构建相应基因缺失金黄色葡萄球菌菌株。方法 提取金黄色葡萄球菌NCTC8325菌株的基因组，以合成的含有GGGG-attB1的基因特异性序列为引物，采用PCR技术分别扩增目的基因片段，应用Gateway基因克隆技术，通过BP反应与含有attP1和attP2的pKOR1质粒载体混合，在attB和attP之间发生位点特异性重组，构建成含有fnbA 、fnbB和fnbAB基因敲除质粒，再电转到金黄色葡萄球菌菌株NCTC8325。结果 构建质粒pKOR1dfnbA、pKOR1dfnbB和pKOR1dfnbAB测序结果正确，经PCR验证，质粒pKOR1dfnbA、pKOR1dfnbB和pKOR1dfnbAB均成功电转入金黄色葡萄球菌NCTC8325菌株。结论 成功构建fnbA、fnbB和fnbAB基因敲除金黄色葡萄球菌菌株NCTC8325，为研究FnBPA 和FnBPB在金黄色葡萄球菌感染机制中的作用提供了有力工具。

金黄色葡萄球菌FnBA活性基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(FnBA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了1 735 bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-FnBA。以HindⅢ和BamHⅠ双酶切pMD18-T-FnBA和pET28a(+),将纯化的基因FnBA亚克隆至pET28a(+)中,构建了原核表达质粒pET28a-FnBA,并将其转化至E.coliBL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约85 000处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带。又经West-ern-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。

金黄色葡萄球菌生物膜形成及相关基因分析

目的探讨金黄色葡萄球菌生物膜表型与相关基因的关系。方法收集100株临床分离的金黄色葡萄球菌,用刚果红培养基法进行生物膜筛选;用电子显微镜观察生物膜的形成;用PCR方法检测生物膜相关基因。结果 100株金黄色葡萄球菌中,79株产生生物膜,阳性率为79.0%。ebh、icaA、icaD、fnbA的检出率分别为53.2%、94.9%、94.9%、81%。金黄色葡萄球菌生物膜阳性菌株和生物膜阴性菌株之间生物膜相关基因ebh、icaA、icaD、fnbA的阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。结论ebh、icaA、icaD、fnbA 4种基因与金黄色葡萄球菌生物膜形成密切相关。

金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(fnbA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了3 600bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pGEM T easy载体中,成功地构建了克隆质粒pGEM-fnbA。以HindⅢ和XhoⅠ双酶切pGEM-fnbA和pET28a(+),将纯化的基因fnbA亚克隆至pET28a(+)中,构建了原核表达质粒pET28a-fnbA,并将其转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约165 ku处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带。Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。