人C-反应蛋白磁微粒化学发光酶免疫测定法的建立

人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是炎症以及各种相关疾病如病毒感染、心血管疾病等诊断、治疗和预后的临床检测指标。为了建立一种快速、准确的CRP定量免疫测定方法,将表达纯化的重组CRP作为抗原免疫小鼠,获得了5株稳定分泌抗体的单克隆抗体细胞株,采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)初步鉴定筛选的抗人CRP单克隆抗体,并分别选择mAb 9D6和mAb 9G4作为捕获抗体与检测抗体,建立用于人CRP检测的化学发光酶免疫测定法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),最后通过测定分析临床血清CRP样本,评价CLEIA的性能。结果显示,基于9D6/9G4-AP单克隆抗体对的CLEIA测定范围为0.1767~500μg/L(可扩展至100 mg/L);所建立的CLEIA与医院采用的免疫散射比浊法(R^(2):0.9496,P<0.0001)表现出良好的相关性,且Bland-Altman分析中96.36%(106/110)的点在95%一致性界限范围内显示两种检测方法具有较好的一致性。结果初步表明,建立的分析方法在临床诊断中具有较好的应用前景。

新型癌抗原125化学发光免疫试剂盒的制备

目的制备新型癌抗原125（CA125）化学发光免疫试剂盒，并进行验证。方法用1株针对CA125蛋白特异性位点的单克隆抗体作为包被抗体，1株针对CA125分子糖链的碱性磷酸酶（ALP）标记单抗和另1株针对蛋白特异性位点的ALP标记单抗分别作为酶标抗体，采用双抗体夹心法，金刚烷增敏化学发光体系作为酶底物制备试剂盒，检测CA125，并对试剂盒进行验证。结果新型CA125试剂盒检测灵敏度达0．1U／ml，测定范围在0．1～430U／ml之间，与传统CA125试剂盒一致；与CA199、CA153和CA50糖蛋白无交叉反应；精密性和准确性良好。与传统CA125试剂盒比较，检测结果有显著性差异，特别是在卵巢癌标本检测方面，糖链单抗酶标抗体制备的试剂盒与普通抗体酶标抗体制备的试剂盒检测结果的比值与其他标本两者的比值之间差异具有统计学意义。结论已制备了新型CA125化学发光免疫试剂盒，其与传统试剂盒检测标本结果的比值更适用于对卵巢癌进行特异性诊断。

前列腺抗原酶促化学发光免疫分析方法学的建立

应用鲁米诺-过氧化氢发光体系建立定量测定血清前列腺特异性抗原含量的酶促化学发光免疫分析方法。该方法测量范围为1.5～80μg/L,灵敏度为0.12μg/L,批内变异<5%,批间变异<15%。回收率为83.8%～118.7%,稀释实验测定值与稀释度呈线性相关,相关系数为0.999。本方法与免疫放射分析方法的相关方程y=1.07x+0.68,相关系数r=0.97。

抗人CA19-9单克隆抗体的制备和鉴定及化学发光检测体系的建立

目的制备抗人糖抗原19-9（CA19-9）单克隆抗体（mAb）,建立双抗体夹心检测CA19-9化学发光体系。方法 CA19-9免疫小鼠后,通过细胞融合技术,获得抗CA19-9的mAb。鉴定其抗体的纯度、效价、特异性和配对,建立双抗体夹心化学发光体系。在包被缓冲液、包被浓度及加样模式上优化化学发光体系,对该体系进行准确度、最低检测限、线性、重复性评估以及血清样本的检测。结果获得4株名称为#1-1、#2-1、#3-1和#4-1的mAb。抗体效价均大于10^-8,与CA125、CA15-3、CA72-4均无交叉反应。其中#3-1 mAb与#2-1-HRP建立的双抗体夹心体系经优化后,其检测范围为0~1 000 U/mL;最低检测限为2.0 U/mL;线性相关系数为0.9999。与罗氏试剂检测结果对比,Kappa系数大于0.75;相关系数大于0.9。结论成功制备了抗人CA19-9 mAb,建立了双抗体夹心检测CA19-9化学发光体系。

抗人CA50单克隆抗体的制备、鉴定及其应用

目的制备抗人糖抗原50（CA50）单克隆抗体（m Ab）,鉴定其免疫学特性并建立化学发光免疫分析法检测体系。方法将人CA50抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选后得到稳定分泌抗CA50抗体的杂交瘤细胞株。经细胞扩大培养及纯化获得m Ab后,建立化学发光免疫分析法检测体系,并对其线性范围、准确度、灵敏度、重复性进行评估,同时进行血样的测定。结果筛选出4株抗人CA50的杂交瘤细胞株,效价均在1∶108以上,2株配对抗体不与CA125、CA153、CA199、CA724交叉。建立的化学发光免疫分析法检测范围为0~500 U/m L,回收率为107.08%,灵敏度为0.83 U/m L,重复性CV值〈10%,与参比试剂检测血样的结果比较符合率为96.7%,Kappa值为0.911。结论成功制备了抗人CA50m Ab,建立了人CA50的化学发光免疫分析法检测体系。

抗氯霉素单克隆抗体的制备及其化学发光酶免疫法的建立

以人工合成的氯霉素-牛血清白蛋白(CAP-HS-BSA)免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术获得了一株分泌抗氯霉素单克隆抗体(CAP-McAb)的杂交瘤细胞5D7,并对其进行效价、亲和力和特异性测定。结果显示,其分泌的抗体亚类为IgG1,间接ELISA检测细胞培养上清效价为1∶512,诱生的腹水经纯化后效价为1∶2×105,亲和常数为3.6×108L/mol;应用上述单抗建立的检测氯霉素的化学发光酶免疫分析法(ci-CLIA),其检测范围为0.001μg/L^10μg/L,检出限达0.0025μg/L,IC50为39.6μg/L,且与L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、青霉素、四环素、庆大霉素等的交叉反应率均小于0.01%,可满足我国对水产品中氯霉素残留检测的要求。

一种单克隆抗体酶免疫测定法的建立及其在检测家畜促滤泡激素中的应用

以牛促滤泡激素(bFSH)为抗原,制备出对bFSH特异的单克隆抗体(McAb)并进行了抗体的纯化和特性分析。以方阵交叉匹配试验挑选出最佳抗体配对,建立了一种可测定微量促滤泡激素的双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)。用IBM-PC微机对DAS-ELISA测出的数据进行了分析。本DAS-ELISA法已成功地应用于家畜血清促滤泡激素水平的检测。

人心肌肌钙蛋白Ⅰ酶促化学发光免疫分析方法的建立

目的建立检测人心肌肌钙蛋白Ⅰ的酶促化学发光免疫分析方法。方法采用两株抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ的单克隆抗体,一株包被聚苯乙烯化学发光板,一株标记辣根过氧化物酶,采用辣根过氧化物酶/鲁米诺/过硼酸钠体系,建立了测定人血清心肌肌钙蛋白Ⅰ的酶促化学发光免疫分析方法,并进行了方法学鉴定。用该法测定80例正常人血清,确定正常参考值范围;测定临床病理样品27例,与Beckman全自动化学发光试剂测定值进行相关性分析。结果本方法测定范围0.3～100μg/L,分析灵敏度0.16μg/L;37℃反应时间30min;回收率76.8%～111.1%;高浓度cTnI血清样品经系列倍比稀释后测定,测定值与稀释度呈线性相关,相关系数0.999;批内、批间变异系数分别为3.90%～6.71%,7.66%～10.34%;与心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白C(TnC)、骨骼肌肌钙蛋白Ⅰ(sKTnI)、骨骼肌肌钙蛋白T(sKTnT)、人心肌脂肪酸结合蛋白(h-FABP)、人心肌肌酸激酶(CK-MB)、人心肌肌红蛋白、C-反应蛋白(CRP)均无交叉;确定临床正常参考值小于0.304μg/L;与Beckman全自动化学发光试剂比较,两者测定值线性相关系数为0.925。结论该方法反应时间短、特异性强、重复性好,具有应用及推广价值。

C-肽化学发光免疫分析方法学研究

目的：建立人血清C-肽化学发光免疫分析法。方法：采用两株高特异的抗C-肽单克隆抗体，以一株包被微孔板制成固相抗体，另一株标记碱性磷酸酶，以金刚烷衍生物为底物，双抗体夹心法测定人血清C-肽浓度。结果：以5μg/ml单克隆抗体包被微孔板，酶结合物以1：5000稀释，在C-肽浓度0．1～15ng／ml范围内线性良好，线性方程为y=0．9575x-0．0869，相关系数0．99；灵敏度为0．01ng／ml，批内、批间变异系数分别为5．8％、8．4％；平均回收率98．4％，范围91．5％～105．0％。结论：文中建立的人血清C-肽化学发光免疫分析法，首次建立小分子人血清C-肽双抗体夹心化学发光免疫法测定。线性好，灵敏度较常规高出一个数量级，准确度和精密性高，能够满足一般临床诊断和科研的应用。

化学发光免疫法检测甲状腺激素及抗体结果的临床意义

目的应用CLIA法和RIA法检测正常人和甲功异常病人的甲状腺激素及抗体的含量,探讨两种检测方法的相关性及结果的临床意义。方法取某院内分泌门诊或住院患者的血清标本分成甲功正常组、甲亢组、甲低组3组,每组40例,分别用两种方法检测其FT3、FT4、TSH、TG、TMA和TGA的含量,分析其统计学差异。结果两种方法比较结果无统计学意义,P>0.05。结论 CLIA法检测甲状腺激素及其抗体,是一项快捷、精确的检测方法,它完全避免了RIA法的废弃物污染、试剂有效期短等缺点。

分析化学发光免疫法检测甲状腺激素及其抗体的应用价值

目的探讨化学发光免疫法检测甲状腺激素及其抗体的应用效果,以便为临床诊治甲状腺疾病提供依据。方法抽取本院2019年1—7月收治的甲状腺激素及其抗体检测患者500例进行研究,均接受化学发光免疫法检测,根据结果分为正常组(n=220)、甲亢组(n=145)、甲减组(n=135),对三组检测结果进行比较。结果甲亢组FT3、FT4、TG-Ab、Tpo-Ab明显高于正常组,而TSH明显低于正常组,比较差异有统计学意义(P <0.05);甲减组FT3、FT4明显低于正常组,TSH、TG-Ab、Tpo-Ab明显高于正常组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论化学发光免疫法检测应用在甲状腺激素及其抗体检测中,可为临床诊断甲状腺疾病提供较为可靠的依据,值得推广应用。

高特异性人血清白蛋白化学发光免疫分析方法的建立

人血清白蛋白（HSA）是人类肝脏功能的重要生物标志物.本研究旨在发展一种具有高度种属特异性和灵敏度的HSA化学发光免疫分析（HSA CLIA）定量检测方法.通过HSA免疫小鼠,制备了6株HSA鼠单克隆抗体;使用间接化学发光检测（Indirect-CLIA）和West blotting检测方法评价单抗对HSA的反应活性;使用免疫组织化学检测（IHC）和West blotting检测方法评价单抗的种属特异性;选择最佳的包被抗体和检测抗体配对;确定HSA-CLIA的定量线性和范围.West bloting和IHC方法中,4F5和5D2抗体反应性最强,且不与小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、猴、鸡等常见实验动物血清白蛋白交叉反应.以单抗5D2配合单抗4F5建立的HSA CLIA,线性范围达到122～31 250 pg/mL,可适用于多种样本的HSA定量检测.本研究发展的单克隆抗体和检测方法为HSA的特异性检测提供了重要工具和手段.

人血清胱抑素C化学发光免疫分析检测系统的建立

目的建立可用于人血清胱抑素C(CysC)检测的化学发光免疫分析(CLIA)系统。方法制备抗人CysC多克隆及单克隆抗体,以单克隆抗体包被发光板,以辣根过氧标记多克隆抗体作为游离抗体,以夹心法为检测原理,建立CysCCLIA检测系统;对自建检测系统进行方法学评价,并与罗氏MODULARP800颗粒增强透射免疫分析(PETIA)系统进行比对。结果自建CLIA检测系统线性范围为0.05～20mg/L,灵敏度为0.05mg/L,标准曲线线性相关系数为0.9997,批内、批间变异系数均小于5%;与罗氏MODULARP800PETIA检测系统检测结果的相关系数为0.9802。结论成功建立人血清CysCCLIA检测系统,该检测系统灵敏度高、精密度好、稳定性高,能够满足临床应用要求。

催乳素酶促化学发光免疫分析试剂盒的研制

采用两株催乳素（PRL）单克隆抗体,一株包被化学发光板,一株标记辣根过氧化物酶,研制了测定人血清PRL浓度的酶促化学发光免疫分析试剂盒。本试剂盒测定范围50~4 000 mIU/L,灵敏度4.26 mIU/L,批内、批间变异系数分别小于10%、15%,回收率90.3%~100.8%;血清样品倍比稀释后的测定值和稀释度的相关系数为1;本试剂盒正常参考值范围：女性43.2~513.1 mIU/L（n=52）,男性54.8~334.3 mIU/L（n=68）。

抗人CA125单克隆抗体的制备、鉴定及化学发光体系的建立

目的制备抗人糖抗原125（CA125）单克隆抗体（mAb），并建立化学发光免疫分析法检测体系。方法将人CA125抗原免疫小鼠，通过细胞融合、筛选后得到杂交瘤细胞株。经细胞扩大培养及纯化获得mAb，鉴定其特异性、纯度、亚型及效价，并建立双抗体夹心ELISA。分别对包被缓冲液、包被浓度和加样模式进行优化和选择后，建立化学发光免疫分析法检测体系，并对其进行评估和血样的测定。结果获得3株抗人CA125的杂交瘤细胞株（30—1—4、31—1-5、43—1-6），不与CA199、CA50、CA724交叉，效价在1：10。以上，用30-1．4和31—1—5建立的化学发光免疫分析法经优化后，检测范围为0～1000U／mL，最低检测限为0．72U／mL，与罗氏试剂检测结果的相关系数大于0．90。结论成功制备了抗人CA125mAb，建立并优化了人CA125的化学发光免疫分析法检测体系，为CA125检测及卵巢癌的诊断奠定了基础。

NSE-McAb化学发光酶免疫分析法的建立及应用

本文在自制8株神经元特异性烯醇化酶单抗(NSE-McAb)的基础上,对4株McAb分别标记辣根过氧化物酶(HRP),经多次方阵排列滴定,建立了NSE-McAb双位点夹心化学发光酶免疫分析法(CLEIA)。通过对23例SCLC,32例NSCLC,22例BPD和正常对照血清中NSE检测表明,对SCLC诊断的阳性率为78.3％,特异性为93.0％,对SCLC的临床分期和判断预后也有一定的价值。

化学发光酶联免疫分析法同时检测3种有机磷农药残留

利用能同时识别对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷的宽谱特异性单克隆抗体,建立了同时测定这3种有机磷农药残留的化学发光酶联免疫分析方法 (chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),比较了间接竞争(ic-CLEIA)和直接竞争(dc-CLEIA)2种反应模式,优化了相关理化参数,确立了最适反应条件。结果表明:间接竞争CLEIA法检测对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷的抑制中浓度(IC_(50))分别为5.57、2.30和2.62μg/kg,检测线性范围分别为0.39~100、0.39~25和0.39~25μg/kg;直接竞争CLEIA法检测对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷的抑制中浓度(IC_(50))分别为5.43、1.34和1.24μg/kg,检测线性范围分别为0.39~100、0.10~25和0.10~25μg/kg。所建立的CLEIA方法基本能满足对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷在谷物和果蔬中最大残留限量的检测要求,为研制有机磷农药多残留检测试剂盒提供了技术依据。

CA125单克隆抗体的制备及其初步应用

利用CA125抗原免疫Balb／c小鼠，采用杂交瘤细胞技术，建立分泌抗CA125抗体的杂交瘤细胞株。将CA125单克隆抗体应用到化学发光免疫分析和免疫放射分析方法中，病理值的测定结果和进口试剂盒测定值相关方程分别为y=0．85x＋11．1，r=0．932和y=0．87x-12．8，r=0．983；正常血样测量值范围分别为3．3～26．7和1．5～27．0U／mL。CA125单克隆抗体制备的包被板和包被管在37℃下可稳定存放14d，且不影响分析结果。

吡虫啉单克隆抗体的制备及其间接竞争化学发光酶联免疫分析方法的建立

以吡虫啉原药和3-巯基丙酸为原料,合成了吡虫啉半抗原,通过活泼酯法将其与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联制备得到完全抗原,经免疫Balb/c雌性小鼠并与骨髓瘤细胞融合获得吡虫啉单克隆抗体,建立了用于吡虫啉检测的间接竞争化学发光酶联免疫分析方法(ic-CLEIA)。优化了方法的包被原稀释倍数、抗体稀释倍数、缓冲液种类、缓冲液的pH值、一抗竞争反应时间、酶标二抗稀释倍数等条件,最适条件为:包被原质量浓度62.50 ng/mL(稀释16000倍),抗体质量浓度103.12 ng/mL(稀释64000倍),缓冲液PBS(pH 7.4),抗原与抗体竞争反应时间30 min,酶标二抗稀释倍数1∶7000。结果表明,在最适条件下该方法的检出限(IC_(10))为0.03 ng/mL,IC_(50)为0.57 ng/mL,线性检测范围(IC_(20)~IC_(80))为0.083~3.99 ng/mL。与氯噻啉的交叉反应率为2.2%,与噻虫胺、呋虫胺、啶虫脒、噻虫啉、噻虫嗪5种吡虫啉结构类似物无明显交叉反应。对黄瓜和苹果样品的加标回收率为82.0%~112%,相对标准偏差小于15%。实际样品检测结果与HPLC仪器方法相关性良好(r^(2)=0.989)。结果表明,所建立的ic-CLEIA方法具有特异性强、灵敏度高的特点,可用于食品中吡虫啉残留的快速检测。

抗肌红蛋白单克隆抗体的制备与鉴定及其初步应用

目的制备和鉴定抗肌红蛋白（Mb）单克隆抗体,为人肌红蛋白检测试剂的研制奠定基础。方法用人肌红蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行细胞融合,用ELISA方法筛选,有限稀释法进行克隆化培养阳性杂交瘤细胞株。ELISA法测定小鼠腹水滴度,CLIA法对抗体进行配对实验与特异性鉴定。结果筛选培养出9株分泌抗肌红蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水滴度为1∶5×104~1∶2×105。通过配对实验,有5株抗体6种组合可以成功配对。这5株抗体的亲和常数为6.46×108~3.68×109L/mol。用5株抗体所建立的6种化学免疫分析方法与人Hb交叉反应率为7.434×10-3%~2.904×10-2%,与人ALB交叉反应率为4.980×10-7%~3.830×10-5%。用Mb17B6与Mb21E8两株抗体建立的CLIA标准曲线的线性系数为0.997,灵敏度为6.02ng/m L。结论成功制备了可以应用于免疫分析的抗肌红蛋白单克隆抗体。