分拣蛋白过表达通过沉默信息调节因子1/叉头盒蛋白O1通路减轻氧化型低密度脂蛋白诱导的肝窦内皮细胞内吞功能障碍的研究

目的探讨分拣蛋白(Sortilin)参与调控氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人肝窦内皮细胞(HLSECs)内吞功能障碍的作用机制。方法体外培养HLSECs,构建Sortilin慢病毒过表达载体(LV-Sortilin)及慢病毒空载体(LV-Con)并转染HLSECs。将细胞分为正常对照(NC)组、ox-LDL组、LV-Sortilin组和LV-Con组。LV-Sortilin及LV-Con感染HLSECs后,加入100μg/ml ox-LDL培养HLSECs 24 h,记为ox-LDL+LV-Sortilin组和ox-LDL+LV-Con组。分别用10μmol/L的EX527和1μmol/L的AS1842856处理LV-Sortilin和LV-Con感染的HLSECs 24 h后,记为ox-LDL+LV-Sortilin+EX527组、ox-LDL+LV-Con+EX527组、ox-LDL+LV-Sortilin+AS1842856组、ox-LDL+LV-Con+AS1842856组。荧光显微镜、RT-PCR和Western blot判断转染效率,CCK-8检测HLSECs活力,RT-PCR和Western blot检测各组Sortilin、沉默信息调节因子1(SIRT1)、叉头盒蛋白O1(FoxO1)、小窝蛋白1(CAV-1)mRNA和蛋白表达。结果LV-Sortilin重组体感染细胞72 h后,LV-Sortilin、LV-Con组细胞出现大量绿色荧光,NC组细胞无绿色荧光。LV-Sortilin组Sortilin mRNA和蛋白表达高于NC组(P<0.05)。与NC组比较,ox-LDL组Sortilin、SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),CAV-1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),Ac-FoxO1蛋白表达升高(P<0.05)。与ox-LDL组、ox-LDL+LV-Con组比较,ox-LDL+LV-Sortilin组Sortilin、SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),CAV-1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),Ac-FoxO1蛋白表达降低(P<0.05)。与ox-LDL+LV-Sortilin组比较,ox-LDL+LV-Sortilin+EX527、ox-LDL+LV-Sortilin+AS1842856组SIRT1、FoxO1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),CAV-1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),Ac-FoxO1表达升高(P<0.05)。结论Sortilin通过SIRT1/FoxO1途径调控CAV-1表达进而调控ox-LDL诱导的HLSECs内吞功能障碍,过表达Sortilin可抑制该病理反应。

叉头转录因子O1在高糖高脂诱导心肌细胞氧化损伤中作用

目的 探讨叉头转录因子O1(forkhead box O1,FoxO1)在高糖高脂诱导心肌细胞氧化损伤中的作用及其对氧化应激相关蛋白MsrA、Nox4表达的影响。方法 对数生长期大鼠H9c2心肌细胞随机分为对照组(正常培养基培养)、高糖高脂组(高糖高脂培养基培养)、FoxO1抑制剂组(高糖高脂培养基培养+FoxO1抑制剂AS1842856)。3组培养24 h后,采用CCK-8实验检测细胞存活率,ELISA法检测细胞上清液乳酸脱氢酶水平,DCFH-DA染色法检测细胞活性氧表达,JC-1荧光探针染色法检测细胞线粒体膜电位,Western blot法检测细胞p-FoxO1、FoxO1、MsrA、Nox4蛋白相对表达量。结果 高糖高脂组细胞存活率[(82.48±2.86)%]低于对照组[(100.00±2.79)%]、FoxO1抑制剂组[(95.95±1.65)%](P<0.05),乳酸脱氢酶水平[(147.20±13.67)u/L]高于对照组[(101.00±3.04)u/L]、FoxO1抑制剂组[(106.20±8.67)u/L](P<0.05);FoxO1抑制剂组细胞存活率、乳酸脱氢酶水平与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组和FoxO1抑制剂组比较,高糖高脂组细胞活性氧表达增多、线粒体膜电位降低。高糖高脂组细胞p-FoxO1/FoxO1(0.96±0.25)低于对照组(1.30±0.34)、FoxO1抑制剂组(1.25±0.24)(P<0.05),MsrA、Nox4蛋白相对表达量(1.05±0.26、1.23±0.15)均高于对照组(0.66±0.22、0.94±0.21)、FoxO1抑制剂组(0.65±0.24、1.00±0.19)(P<0.05);FoxO1抑制剂组细胞p-FoxO1/FoxO1及MsrA、Nox4蛋白相对表达量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 FoxO1过度活化参与高糖高脂诱导的心肌细胞氧化损伤,其机制可能与氧化应激相关蛋白MsrA和Nox4表达上调有关。