连翘酯苷A负调控HMGB1的表达抑制bEECs炎性损伤作用研究

奶牛子宫内膜炎是造成乳品行业巨大经济损失的主要疾病之一,从传统中草药连翘中提取的连翘酯苷A具有广泛的生物活性。本研究旨在阐明连翘酯苷A对大肠杆菌内毒素(LPS)介导的奶牛子宫内膜上皮细胞(bEECs)炎性损伤的抑制作用,并在体外阐明其可能的分子机制。研究结果表明,在LPS诱导的bEECs炎性损伤模型中,连翘酯苷A显著抑制了bEECs的损伤作用;qPCR结果表明,连翘酯苷A能显著抑制促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的释放,并具有剂量依赖性;免疫荧光与免疫印迹结果证实,连翘酯苷A显著抑制高迁移率蛋白1(HMGB1)的表达,进而阻遏p65蛋白的磷酸化。本研究表明,连翘酯苷A通过负调控HMGB1的表达,介导NF-κB信号通路对LPS诱导的bEECs炎性损伤具有保护作用。

HPLC法测定蒙药甘露解毒丸中连翘酯苷A的含量研究

目的:建立高效液相色谱法测定蒙药甘露解毒丸中连翘酯苷A的含量。方法:色谱柱为SHISEIDO CAPCELL PAK C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.4%冰醋酸(15∶85,V/V)为流动相,流速为0.8 mL/min,检测波长330nm,柱温为30℃,进样量为10μL。结果:连翘酯苷A在0.1~1.4μg范围内呈现良好线性关系,线性方程为Y=2302379X+2377(r=0.9999,n=6);专属性良好;精密度和稳定性的RSD分别为0.40%和0.80%。平均加样回收率为94.34%,RSD为1.26%(n=9)。测定两批甘露解毒丸样品,平均含量为0.7772 mg/g,RSD为0.71%。结论:高效液相色谱法测定连翘酯苷A的含量操作简便,重现性好,灵敏度较高,适用于甘露解毒丸中连翘酯苷A的含量测定。

连翘酯苷A对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究连翘酯苷A(FA)对肝星状细胞增殖活化及凋亡的影响。方法 以人肝星状细胞(LX-2)作为实验对象,采用血小板衍生生长因子(PDGF)-BB模拟肝纤维化微环境,实验分为对照组、PDGF-BB组、FA组、PDGF-BB+FA组。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测LX-2细胞活力;采用油红O检测细胞内脂滴的情况;采用免疫荧光染色检测细胞内α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;采用蛋白质印迹技术(Western Blot)检测纤维化相关标志蛋白[α-SMA、α1-I型胶原蛋白(COL1A1)]和凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2蛋白(BCL-2)、剪切的-腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved-PARP)、BCL-2相关X蛋白(BAX)、剪切的-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-CASPASE-3)]的表达;采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 FA处理后LX-2细胞活力明显下降,且呈剂量依赖性;油红O实验结果显示,与PDGF-BB组比较,FA组细胞内脂滴数量较多;免疫荧光染色结果显示,与PDGF-BB组相比,FA组细胞内α-SMA荧光斑点的数量减少;WesternBlot实验结果显示,FA组α-SMA、COL1A1、BCL-2蛋白表达减少,cleaved-PARP、BAX、cleaved-CASPASE-3蛋白表达增加。结论 FA可抑制肝星状细胞的增殖、活化,促进凋亡,改善PDGF-BB诱导的体外肝纤维化。

连翘酯苷B抑制小鼠脑缺血/再灌注引起的氧化应激损伤:基于激活AAMPK/DAF-16/FOXO3通路

目的 研究连翘酯苷B(FB)对脑缺血/再灌注(I/R)引起的氧化应激损伤的保护作用及作用机制。方法 将90只C57BL/6小鼠随机分为5组,假手术组(Sham),模型组(model),FB低、中、高剂量组(10、20、40 mg/kg),采用大脑中动脉阻塞(MCAO)2 h,再灌注24 h,制备脑I/R模型。试剂盒检测小鼠脑组织ROS、MDA、PCO、8-OhdG、SOD、GSTα4、CAT、GPx水平,Western blot检测小鼠脑组织AMPK、P-AMPK、DAF-16、FOXO3、P-FOXO3蛋白表达。在此基础上,采用AMPK抑制剂Compound C(CC)验证FB是否通过AMPK发挥抑制氧化应激损伤作用,将36只C57BL/6小鼠随机分为,Sham组、model组、FB(40 mg/kg)组、FB(40 mg/kg)+CC(10 mg/kg)组。TTC染色检测脑梗死体积,试剂盒检测ROS、SOD水平,Western blot检测小鼠脑组织AMPK、P-AMPK、DAF-16、FOXO3、P-FOXO3蛋白表达。结果 与model组比较,FB可降低小鼠脑组织ROS、MDA、PCO、8-OHdG水平,升高小鼠脑组织中抗氧化酶SOD、GSTα4、CAT、GPx活性,提高AMPK、FOXO3磷酸化及DAF-16蛋白表达水平(P<0.01)。与FB组比较,FB+CC组AMPK和FOXO3磷酸化水平降低,DAF-1表达减少,脑梗死体积增加,ROS水平升高,SOD水平降低(P<0.01)。结论 FB能够抑制I/R引起的脑组织氧化应激损伤,作用机制是通过促进AMPK磷酸化、其下游DAF-16蛋白表达及FOXO3磷酸化,促进抗氧化酶的表达,清除过量ROS,从而发挥治疗缺血性脑卒中的作用。

连翘酯苷A对玉米赤霉烯酮诱导的PK-15细胞凋亡的影响

为探究连翘酯苷A(FA)对玉米赤霉烯酮(ZEA)诱导的猪肾上皮细胞PK-15凋亡的影响及其可能的保护机制,体外培养PK-15细胞,经36.55μg·mL^(-1)ZEA和不同质量浓度(31.25、62.50、125.00μg·mL^(-1))FA处理24 h,采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率;通过Hoechst 33342活细胞染色在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况;利用试剂盒检测细胞上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性和活性氧(ROS)水平;利用实时荧光定量PCR测定细胞中的Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA的表达水平.结果表明:质量浓度在125.00μg·mL^(-1)以下的FA可以提高PK-15细胞存活率;FA能显著提高经ZEA处理的PK-15细胞存活率,且能显著降低经ZEA处理的细胞上清液中的LDH活性,抑制ZEA引起的ROS的生成;ZEA能显著提升Bax、Caspase-8、Caspase-3和Caspase-9 mRNA的表达量,Bcl-2 mRNA的表达量显著降低;不同质量浓度的FA能不同程度地提高Bcl-2 mRNA的表达量,降低Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9 mRNA的表达量.上述结果说明ZEA会诱导PK-15细胞发生凋亡,但FA可通过抑制内源性凋亡途径和氧化应激反应抑制细胞凋亡,从而起到保护作用.

连翘酯苷A对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响

目的探讨连翘酯苷A对白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的软骨细胞损伤的影响及其可能的作用机制。方法采用50 mg/L IL-1β诱导人关节软骨细胞建立细胞损伤模型,记为模型组;另取未处理细胞为对照组。采用1.25、2.5、5.0μmol/L不同浓度的连翘酯苷A处理软骨细胞,依次记为连翘酯苷A低、中、高剂量组。ELISA法检测炎症因子[IL-1β、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]水平;采用流式细胞术检测细胞凋亡率,qRT-PCR检测circSERPINE2表达量。pcDNA、pcDNA-circSERPINE2转染至软骨细胞后用IL-1β处理,si-NC、si-circSERPINE2分别转染至软骨细胞后用连翘酯苷A与IL-1β共同处理24 h,采用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α的水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达量。结果连翘酯苷A作用于IL-1β诱导的软骨细胞后,炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平、细胞凋亡率、Bax蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白、circSERPINE2表达水平升高(P<0.05);转染pcDNA-circSERPINE2后炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)表达水平及细胞凋亡率、Bax蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05);转染si-circSERPINE2后,炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平、细胞凋亡率、Bax蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。结论连翘酯苷A可通过上调circSERPINE2表达而抑制细胞炎症因子表达及细胞凋亡,从而减轻IL-1β诱导的关节软骨细胞损伤。

双波长HPLC法同时测定上清丸中栀子苷及连翘酯苷A含量

目的:建立HPLC的方法测定上清丸中栀子苷及连翘酯苷A含量,对市售上清丸中栀子、连翘的质量进行评价。方法:采用ZORBAX C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸为流动相B,梯度洗脱,流速为1 mL/min,柱温30℃,检测波长为238 nm(栀子苷)、330 nm(连翘酯苷A)。结果:103批上清丸2种成分线性良好(r=0.9997~1.0000),平均加样回收率96.70%~96.92%(RSD值为2.2%)。部分企业上清丸不同批次间栀子苷含量存在较大差异,说明各批次间均一性较差;部分企业上清丸中连翘酯苷A含量差异巨大,主要原因是上清丸中连翘投料不固定,为了保证上清丸质量的均一性,各生产企业应固定青翘或老翘投料。结论:该分析方法简单可行,具有良好精密度、重复性和稳定性,为上清丸中栀子及连翘质量评价提供参考。

不同采收期连翘叶中连翘苷、连翘酯苷和芦丁的含量测定

采用HPLC法测定不同采收期的连翘叶中连翘苷、连翘酯苷和芦丁的含量,综合比较各指标用以评价连翘叶的质量及其最佳的采收期。结果显示:连翘苷以5月份含量最高;连翘酯苷和芦丁以6月份含量最高,连翘叶以5、6月份采收为最佳。

连翘叶中连翘酯苷A、芦丁和连翘苷提取纯化工艺优化

对连翘叶提取液中同时分离连翘酯苷A、芦丁和连翘苷的提取纯化工艺进行优化。以连翘酯苷A、连翘苷和芦丁的质量浓度为指标,采用高效液相色谱法分析检测,比较不同型号的大孔吸附树脂和不同工艺条件对这3种活性成分的分离纯化能力。最佳工艺条件为:以AB-8大孔吸附树脂为吸附剂,药材-树脂比1.5∶1(g/g),上样流速2 BV/h,先用8 BV的水洗脱,再用6 BV的30%乙醇溶液和6 BV的50%乙醇溶液分别洗脱,洗脱流速3 BV/h;进一步采用C_(18)-硅胶柱反相层析法纯化连翘酯苷A,静置沉淀的方法纯化连翘苷和芦丁,纯化后连翘酯苷A和芦丁的纯度可达到97%以上,连翘苷纯度可达到95%以上。此工艺条件能得到高纯度的3种有效成分,为连翘叶资源的充分综合利用和产业化开发提供了参考。

连翘不同部位中连翘酯苷和连翘苷的含量分析

目的:考察连翘不同部位中连翘酯苷和连翘苷的含量。方法:采用 HPLC 法测定连翘根、树皮、枝、叶、花、果实、种子、果壳中连翘酯苷和连翘苷的含量,以 Diamonsil—C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm)为色谱柱,流动相为水(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0～14 min,34%B;14～15 min,34%B～43%B;15～23 min,43%B;23～24 min,43%B～45%B;24～34 min,45%B;34～36 min,45%B～80%B;36～40 min,80%B),流速为1 mL·min^(-1),检测波长270 nm。结果:连翘酯苷在连翘的树皮、叶、花、果实和种子中含量较高,在根、枝、果壳含量很低,连翘苷在连翘叶中的含量远高于其他部位。结论:连翘不同部位连翘甘和连翘酯苷的含量有较大差别,中药连翘应增加连翘酯苷作为标识性成分。

河南和山西连翘叶中总木脂素、连翘酯苷A、连翘酯苷B和连翘苷的含量比较

测定河南和山西连翘叶中总木脂素、连翘酯苷A、连翘酯苷B和连翘苷含量。采用分光光度法测定连翘叶中总木脂素含量,结果显示山西连翘叶高于河南连翘叶总木脂素含量。采用高效液相色谱法(HPLC)测定连翘叶中连翘酯苷A、连翘酯苷B和连翘苷的含量。连翘酯苷A平均回收率为99.6%,RSD为1.23%;连翘酯苷B平均回收率为101.3%,RSD为1.74%;连翘苷平均回收率为102.3%,RSD为2.58%;连翘叶中连翘酯苷A和连翘苷的含量较高,并且不同产地连翘叶中连翘苷含量差异较大;另外对于富含连翘酯苷和连翘苷的连翘叶能否代替果实或者与果实合并用药有待于进一步研究。

RP-HPLC测定连翘病毒清胶囊中连翘酯苷和连翘苷的含量

目的 :建立连翘病毒清胶囊中连翘酯苷和连翘苷的RP HPLC含量测定方法。方法 :采用YWG -C18色谱柱 ( 4. 6mm× 2 50mm ,10 μm) ;连翘苷含量测定流动相乙腈 水 ( 2 5∶75) ,流速 0 8mL·min- 1,检测波长 2 77nm ;连翘酯苷含量测定流动相乙腈 水 冰醋酸 ( 17∶83∶0 4) ,流速 1 0mL·min- 1,检测波长 2 80nm。结果 :连翘苷平均回收率为 99.6% ,RSD 1 9% (n =5) ;连翘酯苷平均回收率为 10 1 3 % ,RSD 2 5% (n =5)。结论 :所建立的方法简便、准确、可靠 。

不同采收期青翘中连翘苷、连翘酯苷和芦丁的含量测定

目的考察不同采收期青翘中连翘苷、连翘酯苷和芦丁的含量,综合比较各指标用以评价青翘的质量及其最佳的采收期。方法采用HPLC法,以Alltima ODS C18柱为色谱柱,流动相为甲醇-水,梯度洗脱,流速为0.8mL.min-1,检测波长为280nm,柱温为室温。结果连翘苷和连翘酯苷以7月初的含量最高,芦丁以7月上、中旬的含量最高。结论青翘的最佳采收期为7月份。

连翘酯苷对IFN-α和Mx1表达的影响

【目的】探讨连翘酯苷作用于感染PCV2的小鼠模型后,对IFN-α和Mx1表达的影响,以评价连翘酯苷的抗病毒作用。【方法】复制PCV2感染小鼠模型。以(2、4、10mg·mL-1)连翘酯苷分为高、中、低3个剂量组,并设空白对照组和病毒对照组。给药12、24、36h后,分别提取小鼠肺组织总RNA和总蛋白,应用实时荧光定量PCR检测IFN-α、Mx1 mRNA含量,采用Western blotting检测Mx1蛋白的表达水平。【结果】空白对照组小鼠肺组织中Mx1和IFN-α无表达,病毒对照组少量表达。随着连翘酯苷浓度的升高,IFN-α和Mx1 mRNA水平逐步升高,两者的表达量呈现平行相关;高剂量组中IFN-α和Mx1表达量最高(P<0.001);随着药物作用时间的延长表达量降低,12h时达到最高(P<0.001),其后逐渐下降。【结论】昆明小鼠适于PCV2感染模型的建立。中药连翘酯苷能显著上调IFN-α和Mx1的表达,并在给予高剂量药物后12h发挥显著的抗病毒作用。Mx1蛋白与病毒的感染密切相关,可用于病毒感染的早期诊断,及具有较好的应用前景。

连翘叶中连翘酯苷A的提取及其抗氧化活性

研究连翘叶中连翘酯苷A的制备及其抗氧化活性。采用有机溶剂提取和柱层析方法制备粗连翘酯苷A,进一步用反相硅胶色谱柱层析得到纯化连翘酯苷A,并用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定其纯度;采用体外抗氧化活性法测定粗连翘酯苷A和纯化连翘酯苷A的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力、羟自由基(·OH)清除能力、超氧阴离子自由基(O_2^-·)清除能力、总还原能力和抗脂质过氧化能力。从连翘叶中分离得到的纯度为62%粗连翘酯苷A和92%纯化连翘酯苷A均具有较强体外抗氧化活性,并且清除DPPH自由基、总还原能力和抗脂质过氧化能力强于阳性对照。连翘叶中连翘酯苷A含量丰富,且具有较强的抗氧化生物活性,是具有良好开发前景的天然抗氧化剂和保健食品及生物药品基料。

连翘酯苷抗感染、解热作用研究

本文观察了连翘酯苷的抗感染作用及解热作用,探讨其与中药连翘清热解毒作用的关系。制备小鼠三种细菌(绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡菌球菌)感染模型,观察动物的死亡数,计算死亡率；复制酵母致大鼠发热模型与内毒素致家兔发热模型,现察不同时间动物体温的变化。结果表明连翘酯苷各剂量组均可显著降低细菌感染模型动物的死亡数和死亡率；均可显著降低发热模型动物的体温。提示连翘酯苷具有明显的抗感染和解热作用。

连翘酯苷药理活性研究进展

连翘酯苷作为中草药连翘中一个主要的有效成分,具有广泛的药理学活性。连翘酯苷不仅能抑制引起感染的各种革兰氏阳性菌和阴性菌,而且还具有较强的抗病毒作用。连翘酯苷通过调控各种细胞因子,发挥免疫调节作用,同时通过清除体内的自由基,发挥抗氧化作用。作者针对连翘酯苷药理学活性进行了综述。

连翘酯苷A对脂多糖诱发的小鼠急性肺损伤的保护作用

目的研究中药单体连翘酯苷A对脂多糖(LPS)诱发小鼠急性肺损伤的保护作用及可能机制。方法采用腹腔注射LPS(10 mg/kg体质量)建立内LPS诱发急性肺损伤小鼠模型;实验分正常对照组,急性肺损伤模型组,抗体组,连翘酯苷A高、中、低剂量组;其中抗体组在造模前12 h前腹腔注射抗小鼠Toll样受体4/髓样分化蛋白2(TLR4/MD2)复合物抗体(50μg/20 g体质量),连翘酯苷A干预组在造模前7 d腹腔注射连翘酯苷A1次/d,剂量分别为(80、20、5)mg/kg体质量;各组小鼠在造模4 h后留取血和肺组织,动态浊度法检测血浆内毒素的含量,HE染色法观察肺组织病理的改变,RT-PCR和Western blot法测定肺组织TLR4的表达,免疫组化测定肺组织MyD88和NF-κB的表达,ELISA检测血清中TNF-α的含量。结果与正常组相比,模型组血浆中内毒素含量显著升高,肺泡间隔明显增厚,充血,水肿及大量的中性粒细胞浸润;与模型组相比,连翘酯苷A用药各组血浆内毒素含量明显下降(P<0.01),肺组织病理损伤不同程度的减轻,TLR4 mRNA和蛋白的表达明显下调(P<0.01),MyD88和NF-κB蛋白的表达也显著降低(P<0.01),血清中TNF-α的含量降低,连翘酯苷A干预各组呈剂量依赖关系。结论连翘酯苷A对LPS诱发的急性肺损伤小鼠起保护作用,其机制可能与其抑制LPS-TLR4-MyD88-NF-κB信号通路有关。

HPLC法测定市售连翘中连翘酯苷的含量

建立了连翘中连翘酯苷的HPLC测定方法 ,采用TIANHEC18柱 (15 0mm× 4 6mm) ,流动相为乙腈—水—醋酸 (15∶85∶0 2 ) ,检测波长为 332nm ,流速为 1 0ml·min-1。连翘酯苷在 0 2 0 2～ 16 2 μg范围内线性关系良好 (r =0 9999) ,平均回收率为 10 0 5 0 % ,RSD =1 6 1%。并测定了陕西市场上连翘药材中连翘酯苷的含量 ,对其质量进行评价。

不同生长期的连翘中连翘酯苷及芦丁含量动态研究

目的对山西野生连翘的最佳采收期进行研究,以期更好地指导生产实践。方法采用高效液相色谱法测定不同生长期的连翘中连翘酯苷及芦丁的含量变化。结果连翘酯苷在6月下旬到7月下旬含量最高,8月有所下降,但幅度不大,9月下降幅度较大。芦丁在6月下旬含量最高,7、8、9月含量逐渐下降。结论6月下旬到7月下旬是山西安泽县野生连翘的最佳采收期,8月次之。