Establishment of Cell Free Conversion System With Biotin-labelled Recombinant PrP^(sen) Expressed in E.coli

Objective To report a protocol using biotin-labelled PrP protein in cell free conversion assay instead of isotope. Methods A hamster PrP protein （HaPrP） was expressed in E. coli and purified with HIS-tag affinity chromatograph. After being labelled with biotin, HaPrP was mixed with PrP^sen preparation from scrapie strain 263K. Results Protease-resistant bands were detected after four-day incubation. Conclusion The new conversion model provides a reliable, easily handling, and environment-friendly method for studies of prion and transmissible spongiform encephalopathies.

放射免疫分析及其进展

文章叙述了放射免疫分析技术过去十多年来的发展,包括杂交瘤技术和DNA重组所提供的抗体和抗原、亲和素-生物素系统的应用、示踪剂制备、免疫放射方法学、分离系统、游离激素测定以及免疫传感器和非同位素标记免疫分析等。

一种新的PrP无细胞构象转化系统的建立

PrP细胞外构象转化系统已经被一些实验室用于朊病毒的研究,但在反应体系中往往需要使用放射性同位素。为了建立一种安全方便的PrP无细胞构象转化系统用于TSE发病机制的研究,通过PCR方法获得仓鼠PrP(HaPrP)全长基因,克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌中表达并纯化出分子量为27kDHaPrP蛋白,Westernblot证实可与PrP特异性单克隆抗体反应。将纯化蛋白在体外标记生物素(Biotin-7-NHS),与纯化的scrapie263K毒株仓鼠感染脑组织PrPSc蛋白共同孵育4天后,经蛋白酶K消化,Westernblot检测,证明存在一条抵抗蛋白酶K消化的、被亲和素特异性识别的条带,其分子量约为20kD。这表明HaPrPsen可以被转化为HaPrPres。实验表明,可以利用原核系统取代真核系统表达PrP,并用生物素标记取代35S标记纯化蛋白,建立一个更加安全方便的无细胞构象转化系统,用于朊病毒的研究。

游离三碘甲腺原氨酸(FT3)生物素-亲合素酶联免疫分析

采用T3抗体包被酶标板微孔、生物素化T3和辣根过氧化物酶(HRP)标记链亲合素作为信号放大体系,一系列定量游离T3(FT3)为标准品,并以四甲基联苯胺-过氧化氢为显色底物,建立了FT3的生物素-亲合素(BA)酶联免疫分析(FT3-BA-EIA)法。其灵敏度为0.90pmol/L,标准曲线范围0.9～45.0pmol/L,批内变异系数3.1%～8.1%,批间变异系数4.9%～10.6%。测定了101例临床血样,其中正常人46例,实测范围2.5～11.1pmol/L,均值为5.1±2.0pmol/L;27例甲亢病人,实测范围9.7～37.3pmol/L,均值为20.5±7.1pmol/L;20例甲低病人,实测范围0.9～3.8pmol/L,均值为2.0±0.9pmol/L;8例孕妇,实测范围为3.4～8.5pmol/L,均值为6.0±2.5pmol/L。通过对临床血样的检测,本法与化学发光法(CIA)及放免法(RIA)的测定结果有良好的相关性。应用本法可有效地诊断甲状腺疾病,具有操作简便、灵敏、快速的特点,适于临床检测和科研应用。

间接包被ELISA法检测血清游离β-HCG

目的研制生物素-亲合素间接包被ELISA法定量检测血清游离β-HCG试剂盒。方法用生物素化牛血清清蛋白和链霉亲合素包被微孔反应板,生物素化抗游离β-HCG抗体和酶标记抗游离β-HCG抗体检测游离β-HCG,评价试剂盒相关技术参数。结果本试剂盒具有较好的稳定性,灵敏度0.1 ng/ml,回收率95.9%～102.5%,批内CV7.5%～11.1%,批间CV12.5%～18.1%,与FSH、TSH、LH和α-HCG的交叉反应率均<0.1%,检测范围0.1～500 ng/ml,与美国DRG公司试剂盒的相关系数r2=0.789 2,P<0.05。结论本方法研制的试剂盒灵敏度高,特异性好,操作方法简便,适于临床常规应用。

利用生物素－亲合素酶联法研究大鼠肝细胞膜上HDL受体特性

用生物素－亲合素酶联法（ＢＡＥ）测定正常大鼠肝细胞表面ＨＤＬ受体的特性。实验结果表明，无载脂蛋白Ｅ高密度脂蛋白（ａｐｏＥＨＤＬ）与大鼠肝细胞具有高亲和力、高专一性结合，其平衡解离常数Ｋｄ＝５．５２ｍｇ／Ｌ，最大结合量Ｂ（ｍａｘ）＝１７３μｇ／ｇ细胞蛋白。本法灵敏度高、反应温和，不影响ＨＤＬ与其受体的结合能力。

微生物法测定婴幼儿奶粉中游离生物素条件优化

微生物法测定婴幼儿奶粉中游离生物素含量因实验室条件差异,严格按照国标方法测定标准曲线线性及结果的准确性及重现性均不太理想。对菌悬液浓度、菌种传代次数以及标准溶液配制方式进行优化,试验结果表明,最佳条件为菌悬液吸光度(A)0.50-0.64、菌种传代不超过5次、标准溶液使用超纯水临用现配的条件下标准曲线符合试验要求,相关系数(R2)可达0.995 6,有较大的提高,此条件下平均回收率92%,变异系数为3.56%。

微生物法检测婴幼儿奶粉中游离生物素方法研究

为了解决微生物法检测婴幼儿配方奶粉中生物素含量常遇到的问题,重点关注了试验过程中的标准曲线、培养基和接种液制备的操作细节。结果表明,采用该方法检测奶粉中的生物素时,标准曲线相关系数(R2)可达0.999 8,有较大的提高;平行测试的RSD为0.75%~2.14%,加标试验回收率在96.08%~98.25%之间,平均回收率为97.54%。通过本方法,优化了菌种活化、菌悬液制备及标准溶液配制过程,提高了检测效率和准确性。