红肉火龙果果糖激酶基因HpFRK1克隆、表达与酶学活性分析

【目的】克隆红肉火龙果果糖激酶基因,检测其表达和酶活性,解析其对果实发育可溶性糖积累的生理功能。【方法】从‘紫红龙’果肉克隆HpFRK1基因,进行生物信息学和亚细胞定位分析,利用qRT-PCR检测基因表达,通过大肠杆菌诱导表达获得重组蛋白并检测酶活性。【结果】HpFRK1的开放阅读框长度为993bp,编码330个氨基酸,具有磷酸果糖激酶B家族结构域。HpFRK1与甜菜BvFRK亲缘关系最近,均属于细胞质定位的FRKs。HpFRK1在成熟茎和不同发育时期果实均表达,在花后20d的果实表达量最高,随果实发育逐渐下调,花后30d(果实成熟)表达量最低。亚细胞定位检测表明HpFRK1主要定位于细胞核和细胞质。诱导获得的Hp-FRK1重组蛋白特异性催化果糖磷酸化(Km为11.01mmol/L)。【结论】HpFRK1在细胞质特异性催化果糖磷酸化,在红肉火龙果果实发育期间负调控果实可溶性糖积累。

4种作物果糖激酶基因的鉴定与比较分析

【目的】基于全基因组序列,鉴定与分析水稻、玉米、高粱和谷子4种作物的果糖激酶(fructokinase, FRK)家族基因,明确其复制起源方式、系统发生关系、序列及表达分化特征等,为深入开展FRK基因功能研究、改良作物产量和品质等提供数据。【方法】采用基因组搜索、基因组内及组间比较等多种方法,分析4种作物FRK家族成员的基因结构、保守基序、系统进化、复制扩张和基因表达分化等。【结果】鉴定到水稻13个、玉米16个、高粱14个、谷子16个FRK基因家族成员,其中水稻11个、玉米7个、高粱12个、谷子13个基因为离散复制基因,水稻、高粱和谷子各有1对ρWGD基因,玉米有8个WGD基因(1个ρWGD基因,7个mWGD基因)。该家族成员亚家族间基因结构差异大,但在亚家族内具有保守性。基因表达模式分析发现,直系同源基因间的表达模式相似,ρWGD基因对发生了明显的表达分化,而玉米物种特异的mWGD基因对的表达差异较小。【结论】探明了4种作物基因组包含的FRK家族基因,揭示了其复制起源、基因结构、序列及表达模式的演化特征。

植物果糖激酶的研究进展

蔗糖是大多数高等植物从源到库运输的主要形式,但进入库器官后被分解为果糖和葡萄糖,果糖的进一步代谢需要果糖激酶进行磷酸化,以帮助库组织的建立和库强的提高。同时果糖激酶还可作为糖感受器和信号分子调控植物的代谢和生长发育,因此果糖激酶在库组织中发挥重要的作用。文章主要介绍了植物果糖激酶的基因克隆、表达、系统发生、结构、分布和生理功能等方面的研究进展。

番茄果实果糖激酶基因的克隆及其表达分析

根据GeneBank中已登记的番茄果糖激酶基因的保守序列设计特异引物,以普通栽培型番茄辽园多丽的果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出果糖激酶基因cDNA序列的部分片段并克隆到pBS-T载体中。测序结果表明,LeFRK1-LeFRK3分别与番茄植物中已知该基因的核苷酸序列相似性高达99%以上,构建了一个番茄、马铃薯、烟草及拟南芥植物中FRK基因的系统进化树。采用半定量RT-PCR方法对番茄果实不同发育时期的表达进行检测,FRK1-FRK3在番茄果实发育的过程中均有表达,但在花后25～35 d时表达量较高。

生长调节剂PCPA和2,4-D对番茄果实果糖激酶活性及基因表达的影响

研究了花期施用PCPA和2,4-D对发育过程中番茄果实糖含量、蔗糖代谢相关酶和果糖激酶活性及果糖激酶基因表达的影响。结果表明,随着番茄果实的发育,果糖激酶的活性及其基因表达均先上升后下降,成熟时达到最低,但FRK1基因表达量较高;果糖和葡萄糖含量呈递增的趋势,成熟时含量达到最高。PCPA和2,4-D处理后降低了成熟番茄果实果糖激酶活性,提高了酸性转化酶活性,促进了FRK1基因表达,提高了成熟番茄果实中果糖和葡萄糖的含量。

枸杞果糖激酶基因LbFRK7的克隆及表达分析

该研究以‘宁杞1号’枸杞果实为材料,基于转录组测序TR28373|c0_g1序列,利用RT-PCR技术,克隆出枸杞果糖激酶基因LbFRK7的全长序列为1 060bp,其中,ORF开放阅读框为1 044bp,编码有348个氨基酸,蛋白质分子量为37.44kD,理论等电点5.05;LbFRK7编码的氨基酸序列包含有pfkB碳水化合物激酶家族高度保守的3个特异性区域,2个底物识别位点,4个ATP结合位点;LbFRK7与烟草和辣椒的FRP7基因序列相似性较高,达到90%;利用实时荧光定量技术分析发现,不同组织中LbFRK7基因均有表达,且果实中的表达量最高,根中最低;随着果实的发育,果实中LbFRK7基因的表达量呈先升后降的变化趋势,并于开花后15d达到最高。在果实发育前期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相同,但在果实发育中期和后期,LbFRK7基因的表达量与果糖含量的变化趋势相反。相关分析结果显示,LbFRK7表达量与果糖和蔗糖含量的相关系数分别为-0.326和-0.339,但均未达到显著水平。研究表明,LbFRK7基因在枸杞果实发育过程中对果糖转化起到一定作用,特别是在果实成熟过程中对果糖含量的升高具有重要的作用。该研究结果为进一步探讨枸杞LbFRK7的功能及果糖代谢奠定了基础。

‘红颜’草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆与表达分析

以‘红颜’草莓果实为材料,经RNA提取后反转录获得草莓果糖激酶基因FaFRK3全长序列,并对其进行生物信息学分析和表达分析。结果表明:草莓FaFRK3基因完整读码框ORF长1158 bp,编码386个氨基酸,其编码蛋白的等电点和相对分子质量分别为5.04和94292.57 ku。草莓FaFRK3基因与其他植物的FRK基因相似度较高,FaFRK3基因编码蛋白属于pfkB糖激酶家族。实时荧光定量PCR发现:FaFRK3基因在‘红颜’草莓不同器官的表达量相差较大,其中在种子中的相对表达量最高,在茎中的相对表达量最低。该基因在不同发育时期的相对表达量也存在差异,随着草莓果实成熟,FaFRK3基因相对表达量逐渐降低。

海巴戟果实发育过程中果糖、果糖激酶及其基因的变化

为揭示海巴戟果实风味形成机制,对果实发育过程的果糖激酶(FRK)活性及其基因的表达模式进行了研究。结果表明,海巴戟果实中的果糖、蔗糖、葡萄糖含量随发育不断积累,均在果实完全成熟时达到最高值,而果糖激酶活性随果实发育不断下降。从果实中克隆了果糖激酶基因TRINITY_DN17192_c0_g1,命名为McFRK2,GenBank登录号为MW380742,其ORF全长为984 bp,编码327个氨基酸,与咖啡(Coffea arabica)的FRK2氨基酸序列相似性为98%。qRT-PCR表明,McFRK2的表达量在果实发育过程中呈下降趋势,当果实成熟时表达的趋于平稳,与果糖激酶活性变化趋势一致。因此,McFRK2可能通过调控果实果糖激酶活性而参与糖代谢,对调控果实风味的形成具有重要作用。

多花黄精果糖激酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶的基因克隆及酶结构性质

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua,PC)果糖激酶(PCFRK)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶(PCGMPP)是黄精多糖生物合成中重要的关键酶,为探究它们在黄精多糖生物合成途径中的作用,基于转录组测序数据分析,利用RT-PCR技术对这两种关键酶基因进行克隆,并分析酶蛋白的理化性质及结构特点。PCFRK开放读码框(ORF)为1725 bp,编码574个氨基酸,具有两个磷酸果糖激酶B家族的特征保守基序;PCGMPP的ORF为1086 bp,编码361个氨基酸,具有焦磷酸化酶家族的保守位点和活性位点。系统进化树分析发现在已知数据库中PC FRK与深圳拟兰FRK亲缘关系最近;而PC GMPP与芦笋GMPP亲缘关系最近。基因表达分析说明PCFRK和PCGMPP在根状茎中的基因表达总量明显高于其他组织,这与多花黄精根茎中多糖含量高于其他组织是一致的。研究为PCFRK和PCGMPP两种关键酶功能的进一步研究及黄精多糖生物合成途径的解析奠定基础。

纤维素堆囊菌源果糖激酶的克隆表达及其酶学性质研究

为促进果糖-6-磷酸的绿色生物制备,该研究对纤维素堆囊菌(Sorangium cellulosum)中的果糖激酶基因进行克隆、表达,探究重组酶酶学性质和底物特异性。以纤维素堆囊菌基因组DNA为模板,设计引物克隆果糖激酶基因SoCeFruK 1852和SoCeFruK 7579,构建重组表达质粒pET30a-SoCeFruK 1852和pET30a-SoCeFruK 7579,并在Escherichia coli(DE3)中诱导表达,纯化重组果糖激酶,研究反应产物和酶学性质。重组果糖激酶SoCeFruK1852和SoCeFruK7579的分子质量大小分别为31.2、32.8 kDa,蛋白质质量浓度为2.04、1.8 mg/mL,比活力分别为35.8、18.3 U/mg。SoCeFruK1852的最适温度和pH分别为37℃和4.5。金属离子Co^(2+)、Fe^(3+)、Zn^(2+)和化学试剂SDS、EDTA、Tween 20对酶活力有抑制作用,而Mg^(2+)和Mn^(2+)对酶活力有促进作用。以果糖为底物时,SoCeFruK1852的K_(m)值为0.54 mmol/L,V_(max)值为1.28μmol/s。SoCeFruK1852能够特异性催化果糖,但也能催化部分D-塔格糖。获得细菌来源的重组果糖激酶SoCeFruK1852和SoCeFruK7579,且SoCeFruK1852显示良好的酶活力和酶学性质,底物特异性较强,为后续相关研究奠定基础。

植物果糖激酶基因家族演化及其功能

在大部分植物中,糖是主要的光合产物以及主要代谢途径的碳原材料,蔗糖在被分解成果糖后主要由果糖激酶进行磷酸化催化。本综述根据近年植物果糖激酶研究新进展,及现有测序完成植物基因组数据,对果糖激酶的基因演化分析作了归纳分析,并综述了单双子叶的果糖激酶分子特征与生化性质,家族成员基因组演化分析和表达特征、亚细胞定位和基因功能,并进一步提出了果糖激酶研究领域的展望。

梨果糖激酶基因PpyFRK5在果实蔗糖积累中的作用

以‘丰水’梨为试材,对果实果糖激酶基因Ppy FRK5进行克隆、表达分析和功能研究。结果表明,Ppy FRK5编码的蛋白属于磷酸果糖激酶B亚家族(pfk B),具有高度保守的pfk B家族特征性结构域及果糖激酶特有的ATP结合域和糖结合域;Ppy FRK5在果实不同发育时期和不同器官中存在差异表达,在成熟的果实和种子中表达量最高;Ppy FRK5定位于质膜和细胞质中;在果实发育的整个过程中,Ppy FRK5的表达与蔗糖含量呈显著正相关,瞬时超表达Ppy FRK5的梨果实蔗糖含量显著升高,瞬时沉默Ppy FRK5的梨果实蔗糖含量显著降低;Ppy FRK5的启动子区域包含多个参与光响应、激素诱导以及胁迫响应的顺式作用元件。