液体发酵茯苓菌5.78培养条件及培养基优化

中国传统原药茯苓(Wolfiporia cocos)具有重要的药用价值,其主要活性成分为三萜类和多聚糖类。为了通过发酵菌丝实现工业化生产茯苓三萜类化合物,本研究采用单因素实验设计不同培养条件和培养基主要成分进行发酵培养,比较分析菌丝干重和总三萜含量,筛选液体发酵生产茯苓三萜的适宜培养条件和培养基。结果表明,碳源葡萄糖、氮源胰蛋白胨、无机盐CaCl_(2)、生物因子土壤浸出物,初始pH 5.5,接种量6%、装液量40 mL和培养11 d可以有效提高茯苓总三萜获得量。初步优化液体发酵培养条件和培养基组分可以为进一步优化茯苓发酵培养生产三萜类化合物提供实验基础。

茯苓多糖合成途径磷酸葡萄糖变位酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因鉴定

采用已报道的灵芝磷酸葡萄糖变位酶(PGM)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPP)基因序列对茯苓基因组进行搜索比对,获得茯苓WcPGM和WcUGPP候选基因序列;以茯苓的cDNA为模板,成功克隆获得WcPGM和WcUGPP基因;随后利用pPIC9K构建2个基因的表达载体,并转化至毕赤酵母进行异源表达。序列分析表明WcPGM和WcUGPP基因全长分别为2021 bp和2144 bp,其中WcPGM基因含有5个外显子和4个内含子,编码564个氨基酸;WcUGPP基因含有11个外显子和10个内含子,编码502个氨基酸。氨基酸序列比对表明,WcPGM和WcUGPP与来源于绣球菌的ScPGM和ScUGPP的同源性分别为87%和91%。酶活测定表明,重组酶WcPGM可转化葡萄糖-1-磷酸(G1P)为葡萄糖-6-磷酸(G6P),酶活达1540 U·mL^(-1);重组酶WcUGPP可催化G1P和尿苷三磷酸(UTP)合成UDP-葡萄糖(UDP-Glc),酶活达660 U·mL^(-1),表明从茯苓中筛选到的2个酶WcPGM和WcUGPP具有PGM和UGPP活性。分子模拟表明,WcPGM在催化可逆反应过程中S114为磷酸供体和受体,R24和K379作为催化酸和碱实现底物的磷酸化和去磷酸化,而E366和S368可实现底物的2种朝向,保障了中间产物葡萄糖-1,6-二磷酸的翻转,确保了WcPGM的可逆反应;而WcUGPP活性中心的核苷酸结合Loop和糖结合Loop保障了底物的正确朝向,K390作为催化碱实现了底物UTP/G1P与UDP-Glc的可逆反应。该研究为茯苓多糖合成途径的解析和代谢工程提升茯苓多糖产量奠定了基础。

黄芪多糖和茯苓多糖对长江鲟幼鱼抗氧化指标、免疫指标和消化酶活性的影响

为了研究黄芪多糖(APS)和茯苓多糖(WCP)对长江鲟幼鱼抗氧化指标、免疫指标和消化酶活性的影响,试验将150尾10月龄长江鲟幼鱼随机分为5组,分别为空白对照组、APS0.1组(按体重添加黄芪多糖0.1 g/kg)、APS0.2组(按体重添加黄芪多糖0.2 g/kg)、WCP0.1组(按体重添加茯苓多糖0.1 g/kg)和WCP0.2组(按体重添加茯苓多糖0.2 g/kg),每组3个重复,每个重复10尾,各组在基础日粮中按照鱼体重量添加不同含量的黄芪多糖和茯苓多糖,用水稀释成糊状,每天灌服1次,连续投喂20 d。试验第20天每个重复随机选取5尾尾静脉采血,分离血清,检测抗氧化指标[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)]、免疫指标[免疫球蛋白(IgG)、免疫球蛋白(IgM)、补体3(C3)、补体4(C4)、碱性磷酸酶(AKP)、γ干扰素(IFN-γ)、溶菌酶(LZM)、抗菌肽(TP)]、抗应激指标[皮质醇(COR)、热休克蛋白-70(HSP-70)、褪黑素(MT)]、肠道消化酶指标[肠蛋白酶、肠脂肪酶、肠淀粉酶],并分析黄芪多糖和茯苓多糖对长江鲟幼鱼抗氧化、免疫、抗应激及消化功能影响程度,同时分析各指标间的相关性。结果表明:与空白对照组相比,APS0.2组长江鲟幼鱼血清SOD、POD、CAT、GSH-Px活性及T-AOC(P<0.05)显著提高,血清MDA含量显著降低(P<0.05),效果好于APS0.1组;WCP0.2组血清POD、GSH-Px活性及血清T-AOC显著提高(P<0.05),血清MDA含量显著降低(P<0.05),效果好于WCP0.1组;APS0.2组长江鲟幼鱼血清IgG、IgM、C3、C4、TP含量及AKP、LZM活性显著提高(P<0.05),且作用效果优于APS0.1组;WCP0.1组、WCP0.2组长江鲟幼鱼血清IgG、C3含量及LZM活性均提高,其中WCP0.2组均与空白对照组差异显著(P<0.05)。APS0.1组、APS0.2组长江鲟幼鱼幼鱼血清COR含量均显著降低(P<0.05)。APS0.2组和WCP0.2组长江鲟幼鱼肠道消化酶活性均显著提高(P<0.05)。黄芪多糖对长江鲟幼鱼抗氧化、免疫、抗应激及消化功能均产生影响,其中ASP0.2组的影响能力强于APS0.1组;茯苓多糖对长江鲟幼鱼的抗氧化、免疫及消化功能产生一定的影响,其中WCP0.2组的影响能力较大,WCP0.1组影响甚微,而对抗应激能力没有产生影响。长江鲟幼鱼抗氧化、免疫、抗应激、消化酶活性指标间存在一定的关联性,但相关性较复杂。说明在日粮中添加适量的黄芪多糖和茯苓多糖均能够增强长江鲟幼鱼的抗氧化、抗应激、免疫和肠道消化酶功能,其中黄芪多糖的作用效果优于茯苓多糖,建议在长江鲟幼鱼日粮中添加0.2 g/kg黄芪多糖。

野生茯苓鉴定及其木质纤维素降解酶系研究

为揭示茯苓木质纤维素降解酶系及培养方式对其主要酶系的影响,该研究通过对野生茯苓菌株进行培养特性的显微观察,利用3对引物PCR扩增进行系统发育学的鉴定,经定性培养筛选出优势菌株YX1,采用酶标仪测定不同条件下茯苓纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶的活力大小。结果表明:(1)茯苓有菌丝体、子实体和菌核3种形态特征。(2)PCR分别获得rDNA-ITS序列1652 bp、核糖体大亚基序列660 bp和翻译延伸因子序列545 bp,提交至NCBI,登录号分别为ON129554、ON129553和ON155840。(3)纤维素酶和半纤维素酶在有松木屑和无松木屑条件下,外切β-葡聚糖酶(CBH)、内切β-葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BGL)最高分泌量分别为16~17 U·mL^(-1)、32~35 U·mL^(-1)、36~37 U·mL^(-1);木聚糖酶、甘露聚糖酶和α-葡萄糖苷酶最高分泌量分别为28~38 U·mL^(-1)、280~342 U·mL^(-1)、9~11 U·mL^(-1);锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(laccase)、木质素过氧化物酶(LiP)这3种木质素降解酶在4种不同培养液中均有微弱的酶活性,木质纤维素酶中的酶活性大小依次为甘露聚糖酶>木聚糖酶>BGL>EG>CBH>α-葡萄糖苷酶>LiP>MnP>Laccase,纤维素酶和半纤维素酶酶活性之间存在显著差异(P<0.05)。综上表明,该研究结合形态学与分子鉴定,明确了野生茯苓YX1的分类地位,与褐腐菌在亲缘关系上既有联系又存在遗传差距,为茯苓产生木质纤维素降解酶系的降解机制提供了基础酶学参考。

茯苓菌丝常规培养和复壮培养的条件优化

通过分析碳源、氮源、培养基初始pH、培养温度对茯苓菌丝生长的影响,优化菌丝常规培养条件,并对已退化的茯苓菌丝进行复壮培养条件优化,以解决茯苓栽培中菌种退化问题。结果表明,茯苓菌丝常规培养最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为玉米蛋白粉加酵母膏,初始pH为6.0,培养温度为31℃,此条件下菌丝洁白、浓密且菌苔较厚;茯苓菌丝复壮培养最佳碳源为麦芽糖,最佳氮源为蛋白胨加酵母膏,初始pH为5.5,培养温度为31℃,此条件下菌丝洁白、浓密且菌苔较厚,菌丝生长速度比复壮前提高了178.85%。

茯苓健脾作用活性部位的研究

通过建立饮食失节、过食肥甘所致的小鼠脾虚模型,以体重、饮食量、外部表现特征及脾指数为指标,从茯苓总三萜类、茯苓总多糖及茯苓水煎剂中确定具有健脾作用的有效活性部位。结果表明:茯苓总三萜类对脾虚小鼠有明显的恢复作用,茯苓水煎剂也有一定作用,而茯苓总多糖作用不明显。说明茯苓总三萜类是茯苓治疗过食肥甘所致小鼠脾虚证的活性部位。

茯苓交配型的初步研究

以茯苓栽培种"大泡引"为研究材料,茯苓菌丝为无锁状联合的多核菌丝,担孢子中双核孢子占75 3%、单核孢子2 4%、无核孢子22 3%。30个单孢株进行单孢配对结果为拮抗现象(不亲和)占总数的26 7%。茯苓菌株具有单孢结实现象,占单孢株总数的18%。由以上结果可初步得出茯苓菌为同宗结合真菌。

茯苓褐腐过程中木材化学成分的变化

用褐腐真菌茯苓按常规栽培方法对木材进行降解,对比研究了正常材和不同腐朽程度木材化学组成之间的差异,用傅立叶红外光谱仪(FTIR)对样品进行表征。结果发现,腐朽初期,综纤维素和戊聚糖的含量及纤维素结晶度随腐朽时间的延长逐渐降低,木质素和1%NaOH抽出物的相对含量却逐渐升高。当腐朽进行到15周时,综纤维素含量、戊聚糖含量和纤维素结晶度分别由正常材的72.80%、14.95%和40.3%下降到18.57%、8.58%和16.1%,木质素含量和1%NaOH抽出物含量分别从27.30%和12.89%增加到43.88%和70.07%。之后,随着腐朽时间的延长,木材的组成几乎保持不变。FTIR结果证实了相同的变化趋势。

茯苓多糖对2型糖尿病小鼠肾组织抗氧化能力及Bax、Bcl-2蛋白表达影响

研究探讨茯苓多糖(WRP)对2型糖尿病(NIDDM)小鼠肾组织抗氧化能力及Bax、Bcl-2蛋白表达影响。采用高糖高脂饲料+小剂量链脲佐菌素(STZ)方式诱导NIDDM动物模型,然后将动物分成正常对照组、模型对照组、WRP灌胃组、罗格列酮灌胃组,药物连续灌胃42 d,检测小鼠肾组织抗氧化能力以及Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果表明,WRP能使NIDDM小鼠肾组织中超氧化物岐化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平明显升高,丙二醛的水平明显降低;即WRP能增强机体肾脏的抗氧化性,降低脂质过氧化,保护自由基介导的氧化损伤,减轻糖尿病对肾脏的损害。WRP能抑制NIDDM小鼠肾组织中Bax基因过多表达;使糖尿病状态下肾组织细胞凋亡趋势受到抑制,对糖尿病肾病具有一定预防作用。

茯苓栽培菌株的RAPD分析

应用RAPD分子标记技术对14个茯苓栽培菌株进行遗传多样性分析,以期探究茯苓栽培菌株间的亲缘关系,为茯苓菌株的鉴别及育种提供DNA依据。研究中应用9个RAPD引物对茯苓栽培菌株进行RAPD分析,筛选出4个RAPD引物,扩增出21条比较明显的条带。利用21条扩增带对14个菌株进行聚类分析,获得14个茯苓栽培菌株亲缘关系树状图。结果显示,在53%的相似值时,14个茯苓栽培菌株可分为2大类群,而在93%相似值时可分为13个类群。

茯苓多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠降糖作用研究

为探讨茯苓多糖(WRP)对糖尿病的治疗作用,采用Ⅱ型糖尿病(NIDDM)小鼠模型,灌胃不同剂量的茯苓多糖28 d,然后测定小鼠血糖、血清胰岛素、胰高血糖素、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等生化指标,并进行口服糖耐量(OGTT)试验。结果表明WRP能有效地降低血糖、血清胰岛素、胰高血糖素、TC、TG和LDL-C水平,增加HDL-C水平;能提高NIDDM小鼠葡萄糖耐受力,改善糖耐量的异常。WRP对NIDDM小鼠具有降糖作用,且能一定程度上改善糖尿病引起脂代谢紊乱情况。

茯苓菌株生物学特性的研究

通过对茯苓菌株在不同碳源、氮源、pH、温度、含水量等环境条件下菌丝生长状况的研究,结果表明在所试的8种碳源、6种氮源中,最适碳源是蔗糖,最适氮源是蛋白胨,菌丝生长的适宜温度是24℃～30℃,最适温度为28℃;培养基的适宜初始pH为3～6,最适pH为3;培养基的适宜含水量为55%～60%,最适含水量为55%。

茯苓中三萜类和多糖类成分的研究进展

主要对中药茯苓中的三萜类和多糖类成分进行了综述。到目前为止已从茯苓的菌核和菌丝中分离到三萜类物质39个,其中羊毛甾-8-烯型三萜12个,羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜16个,3,4-开环-羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜7个,3,4-开环-羊毛甾-8-烯型三萜2个,三环二萜类1个,齐墩果烷型三萜1个;分离到多糖类物质23个。

茯苓棚室代料栽培技术研究初报

以松木屑、松枝碎块、棉籽壳为主要培养料,采用"鲜菌核"作为"诱引",进行菇棚层架菌袋覆土和大田坑穴菌袋覆土两种栽培方式的茯苓栽培实验。其中,以松木屑和松枝碎块为主要原料的栽培料配方栽培效果优于以棉籽壳和松枝碎块为主要原料的配方;菇棚层架栽培和自然露地栽培的产量均低于大田低矮简易棚栽培,在大田搭置低矮简易棚栽培方式获得最好成活率达92.85%,平均生物学效率达18.25%,这一栽培结果与对照的段木茯苓栽培结果接近。

茯苓子实体培养研究

实验从培养基成分、光照、培养温度、传代次数上对茯苓菌株在实验室条件下形成子实体的最适培养条件进行了研究。结果表明,茯苓菌株子实体产生的最适培养条件为培养温度（27±1）℃,光照强度60%,培养时间18~30 d,传代次数5~7代,空气相对湿度75%左右,产生的子实体形态和数量各不相同,可形成蜂窝状、山状、迷宫状、小菊花状或针状的子实体,单生或群生。

茯苓原生质体制备与再生条件的研究

研究了酶、酶解时间、菌龄、稳渗剂等对茯苓原生质体制备与再生的影响。茯苓原生质体制备的最佳条件为：纤维素酶（1．5％）和蜗牛酶（1．5％）的等量混合酶解系统，酶解时间3h，7d菌龄菌丝，产量可达1．77×10^7个／mL。以甘露醇为稳渗剂，采用CYM再生培养基，酶解时间3h，7d菌龄菌丝，其原生质体再生率最高，为0．164％。这一结果为茯苓通过原生质体技术进行菌种改良提供了重要技术参数。

茯苓种质资源的RAPD分析

为探讨国内茯苓人工栽培的主要品种和贵州野生茯苓菌株亲缘关系,利用RAPD技术对供试菌株的基因组DNA进行了分析。从41个随机引物中筛选出17个有效引物,共检测到101个RAPD标记位点,其中39个位点(38.6%)具有多态性,通过PAUP软件进行数据处理,采用最大简约法(MP法)进行聚类分析,并建立系统树。结果表明:不同来源的茯苓菌株亲缘关系非常相近,仅在某些引物的扩增物上存在较小的差异。

茯苓菌种选育及生产技术研究进展

茯苓以其较高的药用价值、营养价值及独特的保健作用而备受关注,科技工作者在茯苓种质资源、菌种选育、栽培技术等方面的研究已取得一定成果。针对茯苓种质资源、育种、生产技术的研究现状和生产栽培中的问题进行了综述,分析了茯苓产业化发展中的主要问题,并提出了解决办法。

不同培养条件对茯苓产孢量的影响

通过比较培养基组成、培养温度、培养基初始pH、光照对茯苓(Wolfiporia cocos)产孢的影响,探讨产孢量较大的培养基组成和培养条件。结果表明:装有60 mL茯苓PDA培养基(200 g马铃薯,20 g葡萄糖,1 g KH_2PO_4,0.5 g MgSO_4·7H_2O,10 mg维生素B_1,18 g琼脂,pH自然,加蒸馏水补足至1000 mL)的350 mL组培瓶,培养基初始pH为6.5,28℃暗培养7 d,12 h光暗交替培养为最优产孢条件,在此条件下,茯苓培养38 d产孢量为(8.12±0.11)×10~9个/瓶。

不同温度贮藏条件下茯苓品质变化研究

以茯苓为试材,在不同贮藏期、不同温度条件下（室温、1-5℃、-20℃）贮藏茯苓药材1年,定期测定其有效成分（多糖、三萜化合物）含量的变化。结果表明：随着贮藏时间的延长,不同温度条件下,茯苓中有效成分含量均呈现下降的变化趋势：前3个月多糖含量迅速下降,此后贮藏于低温条件下其降幅趋缓,而室温条件下经过3个月的稳定期后再次快速下降;三萜化合物含量在不同温度条件下呈现相同的变化趋势,表现为降低-升高-降低-平稳。