猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5-M在大肠杆菌中的融合表达及其ELISA诊断方法的建立

利用谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)表达系统将猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的ORF5和ORF6基因依序串联于GST下游 ,并在大肠杆菌中成功表达 ,获得了大小约为 6 0kD的融合蛋白GST GP5 M ,Westernblot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪繁殖与呼吸综合征P5 6 ELISA检测方法 ,与国外试剂盒IDEXX ELISA总符合率为 94 1% ,表明建立的P5 6 ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。进一步分析了P5 6 ELISA检测结果与血清中和试验的相关性 ,经回归函数分析 ,发现在临床送检猪血清中的抗融合蛋白GP5 M抗体水平 (OD6 30nm)与中和抗体水平之间的相关性并不高。

PRRSV GP5和M抗原中和表位的融合表达与纯化以及间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中和抗体的间接ELISA方法,分析了PRRSV结构蛋白GP5和M的二级结构抗原指数、抗原性、亲水性、表面可及性以及潜在中和表位等参数,选取GP5的47~61、143~156和186~199位氨基酸,M蛋白的63~70、133~146和156~169位氨基酸作为免疫原,构建带接头序列的GP5/M中和表位融合表达质粒;通过优化大肠杆菌表达和蛋白纯化条件,免疫印迹鉴定GP5/M特异抗原,获得了可溶性的GP5/M中和表位融合蛋白。基于纯化的GP5/M中和表位融合抗原,建立了检测猪血清中PRRSV中和抗体的间接ELISA方法。采用建立的间接ELISA方法对6种其他猪源病原阳性血清进行检测,结果均无交叉反应;敏感性试验显示,将血清中和试验鉴定的PRRSV阳性对照血清稀释到1:12800时仍呈阳性;重复性试验显示,批内重复变异系数为2%~10%,批间重复变异系数小于15%;符合性试验显示,同时用建立的间接ELISA方法和血清中和试验对420份临床血清样品进行检测,结果符合率为95.24%。结果表明,该方法操作简单、耗时短,敏感性、特异性、重复性及符合性均良好,具有较好的应用推广价值。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5/M蛋白可溶性表达及免疫原性分析

为表达出高可溶性的GP5／M蛋白并检测其免疫原性，本试验将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的编码核苷酸序列进行密码子偏爱性优化设计，构建了GP5／M融合Grifin、GST、MBP、NusA、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17共10种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导，SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测，筛选出高可溶性表达的GP5／M融合蛋白。重组蛋白通过NiNTAAgarose亲和纯化，免疫家兔，对获得的免抗GP5／M血清进行间接ELISA和病毒中和试验。结果显示，成功构建10个GP5／M表达载体，10个标签中，MBP与GP5／M蛋白相融合的可溶性表达效果最好，并获得了高纯度的MBP—GP5／M重组蛋白质；通过免疫家兔，检测重组蛋白具有免疫原性并能刺激机体产生较高水平的中和抗体。结果表明，试验成功建立了稳定获得GPS／M重组蛋白质的方法，初步鉴定了重组蛋白的免疫效力，为PRRSV亚单位疫苗的后续研究及大量制备奠定基础。