中药治疗腰椎椎体间融合术后发热的炎症信号通路

背景:术后发热是后路腰椎椎体间融合后常见临床症状之一,目前没有明确的病因病机,患者术后体温易反复,病程较久,西药治疗效果欠佳,影响患者术后恢复。目的:综述总结炎症信号通路和术后发热的关联及中药防治后路腰椎椎体间融合后发热的机制,为研究术后发热继续探索新的治疗药物。方法:检索CNKI中国期刊全文数据库、万方数据库和PubMed数据库2006年6月至2023年12月收录的文献,中文检索词为“中药,术后发热,炎症,白细胞介素1,白细胞介素6,白细胞介素8,干扰素γ,肿瘤坏死因子,前列腺素E2,p38丝裂原活化蛋白激酶,核因子κB,Toll样受体,Janus激酶/信号转导和转录激活因子,Notch信号通路”;英文检索词为“medicinal herb,postoperative fever,inflammation,interleukin-1,interleukin-6,interleukin-8,γ-interferon,tumor necrosis factor,Prostaglandin E2,p38 mitogen-activated protein kinase,nuclear factor-κB,toll-like receptor,janus kinases/signal transducer and activator of transcription,notch signaling pathway”。阅读文章剔除研究内容不相关、质量差的文献,纳入100篇文献进行归纳总结。结果与结论:(1)手术造成软组织创伤促使机体释放炎症因子,促炎因子作用于下丘脑前部的体温调节中心,促使发热;(2)术后切口内出血及渗液等的吸收,吞噬细胞吞噬坏死细胞的蛋白分解产物后,产生内生致热原(白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素等)导致发热;(3)细胞因子通过炎症信号通路发挥致炎作用,促使发热;(4)中药或中药复方可以调控炎症信号通路发挥抗炎解热作用防治术后发热;目前中药作用机制尚无定论,应深入研究阐明中医药防治术后发热的相关信号通路,运用现代技术把细胞分子技术与中医药药理作用机制联系起来,以便指导临床医生用药,促进患者术后恢复;(5)中药联合西药治疗术后发热是未来的研究热点,应充分发挥中医药优势,明确不同证型应用中药单体或有效成分提取物和中药汤剂的靶点作用机制。

重组结核分枝杆菌融合蛋白皮肤试验与TST在学校结核潜伏感染筛查中的比较

目的 比较重组结核分枝杆菌融合蛋白皮肤试验(EC)与结核菌素皮肤试验(TST)两种检测方法的筛查效能及成本效益,探讨更适合学校结核潜伏感染的筛查方法。方法 选取2021年9月重庆市某中学高一新生共计283名,采用整群随机抽样方法分为EC组(138名)和TST组(145名),分别于左前臂皮内注射0.1 mL EC或0.1 mL TST,观察注射72 h后皮肤反应。皮肤试验前采集283名学生的静脉血,进行体外γ-干扰素释放试验(IGRA)检测,以IGRA检测结果为标准,分别计算EC、TST试验结果的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率,并分析三者的成本效益。结果 EC的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率分别为54.55%、93.70%、45.45%、90.58%;TST的灵敏度、特异度、漏诊率、一致率分别为61.11%、81.10%、38.89%、78.62%。每检出1例结核分枝杆菌感染者,TST、EC、IGRA的检测成本分别为124.29、492.86、4 879.31元。结论 EC与IGRA检测结果一致性较好,较TST的特异度和一致率更高,检测成本效益较高,简便易行,有望成为学校结核分枝杆菌潜伏感染新的筛查方法。

CFP10/ESAT6融合蛋白-ELISPOT方法的建立及其在结核分枝杆菌感染诊断中的应用价值

目的建立应用酶联免疫斑点试验（Enzyme Linked-Immunospot Assay,ELISPOT）检测结核分枝杆菌感染的方法 ,评价CFP10/ESAT6融合蛋白抗原在检测结核分枝杆菌感染中的应用价值。方法通过比较不同的实验条件确定ELIS-POT检测结核分枝杆菌感染方法的最佳细胞浓度、孵育时间、蛋白抗原浓度等,建立ELISPOT方法。以PPD皮肤试验作对照。结果 ELISPOT方法的最佳实验条件为：每孔细胞浓度2×105,CFP10/ESAT6融合蛋白抗原浓度20~40μg/mL,细胞孵育时间20h。应用PPD皮试检测30例健康体检者、38例非结核疾病患者和40例结核病患者的阳性率分别为40.0%、0%、72.5%,而ELISPOT检测的阳性率分别为20.0%、10.5%、92.5%。应用ELISPOT检测40例结核病痰菌阳性组和阴性组的灵敏度分别为94.4%、90.9%。结论应用CFP10/ESAT6融合蛋白作为抗原建立的ELISPOT方法可初步应用于诊断结核分枝杆菌感染、辅助结核病诊断。

猪干扰素α、β和γ的融合表达及活性

【目的】研制高效的猪基因工程干扰素制剂用于猪病毒性和肿瘤性疾病的防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术将PoIFN-α、PoIFN-β和PoIFN-γ成熟肽基因进行连接,形成3种融合基因PoIFN-α/β、PoIFN-α/γ和PoIFN-β/γ,并构建到原核表达载体pET30a进行融合表达,用细胞病变抑制试验和淋巴细胞转化试验测定融合蛋白rPoIFN-α/β、rPoIFN-α/γ和rPoIFN-β/γ的生物学活性,同时与非融合干扰素rPoIFN-α、rPoIFN-β和rPoIFN-γ进行比较分析。【结果】成功构建了3种融合基因,并在大肠杆菌中实现表达,经纯化、复性得到3种具有生物学活性的融合蛋白rPoIFN-α/β、rPoIFN-α/γ和rPoIFN-β/γ。细胞病变抑制试验结果表明,无论是在Marc-145还是在PK-15细胞上,3种融合蛋白均具有较强的抗病毒活性,其抗PRRSV或VSV活性明显高于非融合的rPoIFN-α、rPoIFN-β和rPoIFN-γ,体现出一定的叠加效应;MTT法检测淋巴细胞转化试验结果显示,rPoIFN-α/γ和rPoIFN-β/γ能有效刺激淋巴细胞转化,具有良好的免疫学活性;而rPoIFN-α/β效果不明显。说明Ⅰ型与Ⅱ型PoIFN之间能协同调节免疫,而Ⅰ型的不同亚型之间无明显协同作用。【结论】3种融合干扰素具有较强的抗病毒活性,可以用于猪病毒性和肿瘤性疾病的防治,其中rPoIFN-α/γ和rPoIFN-β/γ还具有较强的免疫增强作用,可被开发成新型的免疫增强剂。

脑啡肽-干扰素融合蛋白具有外周镇痛作用

研究干扰素 -脑啡肽融合蛋白的外周镇痛作用和机制。对小鼠进行热损伤诱导 ,采用经典热板法测定小鼠后肢脚趾外周涂抹干扰素、脑啡肽融合蛋白的痛阈变化 ,并用阿片选择性拮抗剂纳曲酮、纳络酮及干扰素单抗进行阻断试验。与干扰素母体相比 ,融合蛋白具有较强的外周镇痛作用 ,这种作用可被纳络酮、干扰素单抗逆转或阻断。融合蛋白具有较强镇痛功能 ,可作为外用镇痛候选药物 ,其作用机理与干扰素受体、阿片

融合干扰素rPoIFN-α/β联合黄芪多糖抗病毒活性研究

以融合干扰素rPoIFN-α/β和黄芪多糖(APS)作为抗病毒药物,采用MTT法与细胞病变(CPE)抑制试验评价了二者联用抗PRRSV,CSFV和PRV 3种猪源性病毒的效果.结果显示,融合干扰素rPoIFN-α/β和黄芪多糖(APS)联合使用对PRRSV,CSFV和PRV 3种猪源性病毒抑制作用远远高于单独使用,体现出显著的协同抗病毒效应,为融合干扰素与黄芪多糖的联合用药防控病毒性疾病提供了理论基础.

人β干扰素-血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

利用重叠PCR技术在体外拼接IFNB和HSA基因,将得到的融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白IFNβ-HSA。重组质粒pPIC9K-IFNβ-HSA经SalI线性化,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到高拷贝转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白IFNB-HSA,表明该蛋白分子量约为90kDa,且具有HSA的抗原性;用细胞病变抑制法测定发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640IU／ml。

猪γ-干扰素的克隆表达及单抗的潜在应用

以刀豆素A(ConA)刺激长白猪外周血单个核细胞(PBMC),提取的总RNA为模板,采用一步法RT-PCR扩增出包含猪γ-干扰素(PoIFN-γ)完整基因的片段。将完整的PoIFN-γ基因亚克隆到pET-32a(+)上,构建pET-IFN-γ融合表达载体,转化入Rosetta(DE3)后IPTG诱导表达,得到大小约为36.8kD的目的蛋白。将目的蛋白检测及纯化后免疫后BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,最终筛选出3株能稳定分泌抗猪IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞。ELISA叠加试验显示,3株单抗针对相同或邻近的PoIFN-γ抗原表位,制备的腹水中单抗间接ELISA效价为1×104。选取单抗IF-2株进行单抗的潜在应用研究,Westernblotting分析结果显示单抗IF-2株能与融合表达蛋白产生特异性反应,与pET-32a(+)标签蛋白无反应;间接免疫荧光检测(IFA)发现,在采用腺病毒表达系统表达PoIFN-γ的HEK-293细胞中散在大量特异性荧光。

人干扰素和脑啡肽融合蛋白的表达和生物学活性

以INFα -m基因为模版 ,采用overlappingPCR技术构建甲硫氨酸脑啡肽干扰素表达质粒 pBV2 2 0 /Enk - /Met-INFα -m ,转化大肠杆菌DH5α表达 ,产物以包涵体形式存在。包涵体经分离、变性、复性 ,然后经CM -Sepharose-FF、DEAE -Sepharose -FF离子交换层析和Sephacryal-HR10 0分子筛纯化 ,获得较纯的Enk -IFNα -m融合蛋白。生物活性检测表明 ,融合蛋白不仅具有干扰素的抗病毒、抗增殖、增强NK细胞功能的活性 。

热休克蛋白65-MUC1融合蛋白对小鼠干扰素γ产生细胞的诱生作用

目的 :研究热休克蛋白 6 5 - MU C1 (HSP6 5 - MU C1 )融合蛋白对小鼠免疫细胞的激活作用。方法 :用HSP6 5 - MU C1融合蛋白免疫 C5 7BL/ 6小鼠 3次后 ,取脾脏和淋巴结 ,分离淋巴细胞 ,体外用 HSP6 5 - MU C1融合蛋白、 MUC1肽或非特异性刺激剂如 Cp G ODN和 Con A进行刺激 ,采用酶联免疫斑点法 (enzyme linkedim munospot,EL ISPOT)检测免疫细胞分泌干扰素 γ的情况。结果 :HSP6 5 - MU C1融合蛋白免疫后小鼠的淋巴细胞在特异性或非特异性抗原刺激下所分泌的干扰素 γ比 PBS组明显增多。结论 :HSP6 5 - MUC1融合蛋白对小鼠干扰素

猪Ⅰ型干扰素融合表达及其抗病毒活性检测

采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术将猪I型干扰素PoIFN-α和PoIFN-β成熟肽基因进行连接,构建表达载体pET30a-PoIFN-α/β进行融合表达,利用细胞病变抑制试验检测融合干扰素rPoIFN-α/β抗病毒活性,并与非融合干扰素rPoIFN-α和rPoIFN-β进行比较分析。结果表明,在PK-15细胞上,融合干扰素rPoIFN-α/β表现出较强的抗病毒活性,其对VSV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PASTV、PEDV和TGEV的抗病毒活性明显高于非融合干扰素,体现了一定的叠加效应,可以用于猪病毒性疾病的防治。

融合蛋白IFN-IgGFc在乳酸乳杆菌中的表达及其生物学活性研究

用乳酸菌表达有药用价值的生物学活性多肽,是当前国际上的研究热点之一,对开发新的功能性食品具有广阔的前景。本文应用PCR方法将人干扰素IFN-α-2b基因与IgGFc基因连接,并引入一段柔性连接肽,构建了融合蛋白基因IFN-IgGFc,将融合蛋白基因克隆到原核表达载体pSC111AE中,转化乳酸乳杆菌ATCC393进行诱导表达及鉴定,并研究了融合蛋白的生物学活性。结果表明,通过Western-Blot方法在表达上清液检测出干扰素融合蛋白,ELISA测定表明两段多肽能够保持各自的构象,基因工程乳酸菌表达的上清液可以诱导WISH细胞产生明显的抗VSV病毒的活性,其活性为1.71×103IU/ml。本文首次构建并在大肠杆菌和乳酸菌表达了IFN-IgGFc融合蛋白,获得了能产生人干扰素的乳酸菌株,为基因工程乳酸菌及相关药物的开发研究奠定了基础。

脑啡肽-干扰素α-m融合蛋白外用治疗单纯疱疹病毒感染

为探讨脑啡肽 -干扰素α -m融合蛋白 (EI)外用治疗单纯疱疹病毒感染的作用 ,分别用HSV - 1感染兔子角膜、HSV - 2感染豚鼠阴道建立动物感染模型。兔子角膜感染 2 4h后用融合蛋白滴眼液治疗 ,每天 3次 ,每次0 5ml,共 14天。豚鼠阴道感染 4 8h后 ,用融合蛋白涂剂抹外阴病灶 ,每天 3次 ,每次 10mg ,共 14天。用IFNα -m和生理盐水 /赋形剂作为对照。采用记录病损程度分级法进行临床症消减观察 ,并于治疗前后测定实验动物病灶病毒滴度、HSV抗体滴度及NK细胞活性。结果显示 :与IFNα -m相比 ,EI治疗组实验动物病毒感染症状大幅减轻且病程缩短 ,动物病灶中病毒滴度下降 ,抗HSV抗体滴度升高 ,NK细胞活性增强。说明脑啡肽干扰素融合蛋白具有较强的消除炎症和局部抗病毒作用 。

口蹄疫病毒VP1-3免疫表位基因与猪γ-干扰素基因的融合表达

将人工合成的口蹄疫病毒VP1-3上的抗原表位基因和猪γ-干扰素基因串联入原核表达载体pGEX-KG中,经酶切鉴定及测序表明重组载体中二者以接头融合的形式构建成重组表达质粒。将该质粒转化BL21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,重组蛋白分子量约为66 Ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示表达的重组蛋白占菌体总蛋白的37.4%,且主要以包涵体的形式存在。包涵体以SKL变性后,经PEG4000、氧化型谷胱苷肽和还原型谷胱苷肽复性。粗提产物以CPE_(50)测得重组蛋白在MDBK细胞上的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的活性达到1600 U/mL,说明表达产物具有干扰素的生物学活性,为下一步基因工程疫苗的研究奠定了基础。

奶牛β-干扰素在大肠杆菌中高效表达和生物活性分析

提取经植物血凝素诱导培养的中国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛β-干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,扩增片段为奶牛β-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达。表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的40%。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性。重组奶牛β-干扰素抗病毒活性分别约3.16×105U/mL,7.5×104U/mL。结果表明,重组奶牛β-干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定。本研究为研制和开发重组奶牛β-干扰素类生物制品研发奠定了基础。

重组融合蛋白Trx-IFN-CSP复性工艺研究

旨在建立并优化融合蛋白Trx-IFN-CSP的复性工艺。对重组融合Trx-IFN-CSP进行体外复性研究,考查p H、温度、蛋白浓度、氧化还原体系及辅助复性小分子等复性条件对融合蛋白重折叠的影响。结果显示,适合Trx-IFN-CSP复性的方法为,反复冻融联合超声破菌获得包涵体;用含有1%Triton X-100、2 mol/L尿素、2%DOC洗涤液初步纯化包涵体;再用6 mol/L盐酸胍溶解液变性包涵体;脉冲加样稀释变性液后4℃条件下梯度透析复性,使用L-Arg辅助复性。经肠激酶切去Trx标签后,每升发酵液最终获得110-130 mg肝靶向干扰素,每批蛋白纯度都在95%以上,比活性在1.9-2.4×108 U/mg之间,制备工艺稳定。

重组人血清白蛋白-干扰素α-2b 融合蛋白体外抗乙型肝炎病毒活性评价

目的检测重组人血清白蛋白-干扰素α-2b融合蛋白(HSA-IFNα-2b)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法构建含1.6倍HBV基因组及绿色荧光蛋白的重组腺病毒(AdGFP-HBV),感染人肝细胞系HepG2细胞,构建HBV复制细胞模型;ELISA法检测HBV乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)表达;MTT法检测HSA-IFNα-2b对HepG2细胞的毒性作用;定量PCR法检测细胞内HBV RNA的相对表达以及细胞上清中HBV DNA绝对表达水平;双报告基因法检测HSA-IFNα-2b对HBV增强子Ⅰ活性的影响。结果 AdGFP-HBV感染HepG2细胞后可以复制表达HBV。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1加入AdGFP-HBV感染的HepG2细胞,使HBsAg表达降低51.32%(P<0.01),HBeAg降低50.26%(P<0.01),而相同浓度的HSA-IFNα-2b并不抑制细胞的增殖。随HSA-IFNα-2b浓度增加,其对HBsAg表达的抑制作用逐渐升高,HSA-IFNα-2b对HBsAg表达的抑制率(Y)与其浓度(X)的回归方程是Y=21.11 lgX+11.91(r2=0.954),IC50为63.76 kU·L-1。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使细胞中HBV RNA下降52.83%(P<0.01),培养上清中HBV DNA降低53.07%(P<0.01)。HSA-IFNα-2b 500 kU·L-1使HBV增强子Ⅰ活性下降40.04%(P<0.01)。结论构建了可用于药物评价的HBV复制细胞模型,HSA-IFNα-2b体外具有抗HBV活性。

猪白细胞介素6和α干扰素基因的融合及其原核表达

为了获得猪白细胞介素6(IL6)和α干扰素(IFNα)双重活性的融合蛋白,研究其作为免疫佐剂的可行性,利用IL6和IFNα基因的编码区序列以及原核表达载体pET32a序列,设计了带有限制性内切酶位点、Linker序列以及His标签的特异性引物扩增出猪IL6和IFNα的成熟肽基因序列,并分别与克隆载体pMD18连接后转化Esche-richia coli DH5α,提取质粒酶切并连接构建重组质粒pMD18-IL6-IFNα。将该重组质粒和表达载体pET32a同时酶切并连接构建pET32-IL6-IFNα重组质粒,依次转化E.coli DH5α和E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,并经不同终浓度的IPTG以及不同时间的诱导表达。结果成功构建了IL6和IFNα的融合表达载体,SDS-PAGE检测pET32-IL6-IFNα融合蛋白在E.coli Rosetta(DE3)中得到了较高表达,且经1.00 mmol/L IPTG诱导7.0 h后表达量最大,目的蛋白的相对分子量为44 960,与理论预期值一致。SDS-PAGE检测显示融合蛋白主要以不溶性的包涵体形式存在。

重组结核杆菌融合蛋白在大学生结核潜伏感染筛查中的应用分析

目的通过分析重组结核杆菌融合蛋白(recombinant mycobacterium tuberculosis fusion protein,EC)皮肤试验和γ干扰素释放试验(interferon-gamma release assay,IGRA)结果,探讨EC皮肤试验在筛查学生结核杆菌感染中的实用性,为进一步做好学校结核病疫情控制提供建议。方法选取1924例同学的IGRA和EC皮肤试验结果进行分析,检验结果一致性采用Kappa检验,采用配对χ2检验两组检测方法之间的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。结果共纳入1924例研究对象,其中男生1274例,女生650例;IGRA阳性率5.35%;EC皮肤试验阳性率9.10%,不同检测方法阳性率之间差异具有统计学意义(配对χ^(2)=37.57,P<0.01),Kappa值为0.47,两种检测方法检测结果为中度一致性。以γ干扰素检测作为结核感染的金标准,EC皮肤试验的敏感度为67.96%、特异度为94.23%、阳性预测值为40.00%、阴性预测值为98.11%。结论EC皮肤试验具有较强的特异性,可用于大学生结核病筛查。

组氨酸标签人β干扰素在E.coli BL21(DE3)中的表达、纯化和活性测定

目的在大肠杆菌中高效表达组氨酸标签与人β干扰素融合蛋白,并进行蛋白纯化和生物活性测定。方法提取人Bel-7402细胞总DNA为模板,经PCR获得人β干扰素编码基因片段。将此基因插入表达载体pET-16b,重组克隆,经酶切与测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和条件优化。表达产物经Western blotting分析,用Ni sepharose亲和层析纯化,纯化产物进行干扰素生物学活性测定。结果经表达条件优化后,SDS-PAGE显示重组菌株表达与组氨酸标签人β干扰素分子量大小一致的条带,进一步的Western blotting分析中发现表达的蛋白能与人β干扰素抗体及组氨酸标签抗体产生结合反应,亲和层析纯化分离得到纯度92%的组氨酸标签人β干扰素,干扰素生物学活性测定表明,获得的组氨酸标签人β干扰素比活性为4.2×107U/mg。结论组氨酸标签人β干扰素编码基因在大肠杆菌中成功表达。建立了该蛋白的简便亲和纯化方法,表达产物具有人β干扰素生物学活性,为进一步以此系统表达及纯化其他具有生物学活性的科研用标签化细胞因子奠定了基础。