穿膜融合多肽TAT-N24对Jurkat细胞增殖的影响

目的观察穿膜融合多肽TAT-N24对急性T细胞白血病Jurkat细胞增殖的影响。方法以穿膜融合多肽TAT-N24处理Jurkat细胞,噻唑蓝(MTT)法观察细胞的生长情况,应用流式细胞仪检测Jurkat细胞周期进程。结果穿膜融合多肽TAT-N24处理急性T细胞白血病Jurkat细胞48 h,细胞生长受到抑制,随着多肽浓度的增加,抑制作用增强,表现出明显的浓度依赖性(P<0.05);48 h后细胞生长明显受抑,并随时间延长生长受抑更加明显,表现出时间依赖性(P<0.05)。空白对照组Jurkat细胞中G0/G1期细胞数为(41.91±1.96)%,S期和G2/M期细胞数分别为(52.16±1.76)%和(5.93±0.30)%;对照多肽组Jurkat细胞中G0/G1期细胞数为(46.38±2.31)%,S期和G2/M期细胞数分别为(44.22±1.69)%和(9.40±0.98)%;TAT-N24组Jurkat细胞中G0/G1期细胞数为(54.83±1.92)%,S期和G2/M期细胞数分别为(30.75±2.27)%和(14.42±0.68)%。结论融合多肽TAT-N24可以有效抑制急性T细胞白血病Jurkat细胞的增殖,阻滞其周期进程。

穿膜融合多肽TAT-N24对S180腹水瘤生长的抑制作用

目的观察穿膜融合多肽TAT-N24对S180腹水瘤生长的抑制作用。方法建立S180腹水瘤小鼠模型,以不同剂量TAT-N24腹腔内注射,观察TAT-N24对腹水瘤小鼠腹水生成的影响,流式细胞仪检测腹水瘤细胞细胞周期进程,应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测TAT-N24对细胞DNA合成的影响,验证TAT-N24的抗肿瘤作用。结果腹水测量结果显示,模型对照组腹水为(8.3±2.3)mL,实验组分别为:TAT-N245μL组(3.2±1.2)mL,TAT-N2420μL组(2.7±1.0)mL,TAT-N24100μL组(1.3±0.2)mL;结果提示给予腹腔注射TAT-N24能显著抑制腹水的生成(P<0.05);BrdU/PI双掺入法检测细胞DNA合成结果显示,对照组BrdU阳性细胞数占总细胞比例为(25.86±3.54)%,而给予TAT-N24高剂量(100μL)组BrdU阳性细胞数占总细胞比例为(5.91±0.57)%,2组间差异有统计学意义(P<0.01);对照组动物腹水瘤细胞中G0/G1期细胞为(63.88±4.01)%,S期和G2/M期细胞分别为(23.93±2.91)%和(12.19±1.62)%,而TAT-N24高剂量组动物腹水瘤细胞G0/G1期细胞增加至(83.71±1.53)%,S期和G2/M期细胞分别为(7.56±1.40)%和(8.72±0.73)%,2组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论融合多肽TAT-N24能有效抑制S180腹水瘤小鼠的腹水生成,阻滞腹水瘤细胞细胞周期进程,抑制细胞DNA合成。

人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达

目的获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-PCR扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变:A75T,H124Y,通过二次PCR将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE,Western blot检测显示有融合蛋白GST-IL-24表达。结果通过RT-PCR及二次PCR得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论IL-24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GST-IL-24融合蛋白。

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的:构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24cDNA片段,并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中,实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和West-ernblot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果:酶切结果证实,成功地构建了pGEX-KG IL24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致。GST-IL24融合蛋白能够抑制THP1细胞的生长。结论:成功地构建了重组表达载体pGEX-KG-IL24,并在E.coliBL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白,为下一步研究人IL24的功能奠定了基础。

MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白的制备及其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

目的:构建MDA-7/IL-24-HT7原核及真核表达质粒,制备MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白,研究该融合蛋白在肿瘤细胞内的定位及其对肿瘤细胞致凋亡作用。方法:PCR扩增MDA-7/IL-24基因,插入含有HaloTag(HT7)标签的载体中,构建MDA-7/IL-24-HT7原核及真核表达质粒;MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白经IPTG诱导表达后纯化。利用带有荧光标记的HT7配基观察MDA-7/IL-24-HT7在肿瘤细胞内的定位。MTT法及AnnexinV-PI染色法检测MDA-7/IL-24-HT7对肿瘤细胞生长和凋亡的影响。结果:成功构建了表达MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白的原核及真核表达质粒,MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白主要存在于E.coliBL21的包涵体内。MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白定位于肿瘤细胞的内质网上。MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白可抑制肿瘤细胞的生长,1mg/mlMDA-7/IL-24-HT7融合蛋白作用大肠癌HCT116细胞、肝癌SMMC7721细胞96h后,细胞凋亡率分别为(34.7±1.3)%和(22.1±0.9)%,显著高于未处理的肿瘤细胞(P<0.01)。结论:带有HaloTag标签的MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白可抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。

IL-24融合蛋白表达载体的构建及其对人小肠癌细胞的生长抑制作用

目的:构建人白细胞介素-24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达．研究IL-24融合蛋白对人小肠癌细胞(HIC)的生长抑制作用．方法:用PCR从质粒TRAP-hIL-24中扩增人 IL-24 cDNA片段,并将该片段插入DGEX-KG 原核表达载体中,实现插入基因的融合表达．用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定．提取并纯化IL-24融合蛋白,以不同浓度与 HIC细胞共培养72 h,同时设立相应浓度梯度的GST蛋白组、HIC细胞对照组及空白孔,采用MTT法检测各组人小肠癌细胞的体外增殖结果:酶切结果证实,成功地构建了pGEX- KG-IL-24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(Mr) 同预期值相一致,融合蛋白为Mr53 000,GST 蛋白为Mr29 000．IL-24融合蛋白以浓度依赖性的关系抑制HIC细胞的生长,并且在20和40 mg／L时的抑制率明显高于GST蛋白．结论:成功地构建了重组表达载体pGEX-KG- IL-24,并在E.coli BL21中表达．IL-24融合蛋白对HIC细胞生长有抑制作用．

表皮生长因子受体干扰序列与白细胞介素24融合蛋白的原核表达

目的:在大肠杆菌中表达表皮生长因子受体干扰序列(EGFRi)与白细胞介素24(IL-24)的融合蛋白。方法:人工合成肿瘤细胞表面受体特异性结合位点EGFRi核苷酸序列,应用重叠延伸PCR技术将其与IL-24基因连接,其间引入一段柔软短肽编码基因;将融合基因克隆入pET-22b原核表达载体,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对表达条件进行优化;用His.Bind纯化试剂盒对表达产物进行纯化,SDS-PAGE进行鉴定。结果:酶切和测序结果证实EGFRi-IL-24融合基因的原核表达载体构建正确;在IPTG浓度为0.8mol/L、28℃诱导10h的条件下,可溶性融合蛋白表达量最高;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为22000;经纯化得到了均一的融合蛋白。结论:获得大肠杆菌表达的融合蛋白EGFRi-IL-2,可用于活性分析。

非融合rIL-24蛋白的制备及活性鉴定

目的制备非融合的rIL-24蛋白,鉴定其体外诱导肿瘤细胞凋亡活性。方法为制备非融合IL-24蛋白,将IL-24基因插入到pET32a(+)上KpnⅠ与BamHⅠ之间,构建表达载体IL-24/pET32a,IPTG诱导在E.coliBL21(DE3)中表达。洗涤后的包涵体溶解在2 mol/L尿素(pH9.0)中,采用镍离子亲和色谱和凝胶分子筛的二步法纯化,肠激酶酶切(肠激酶与蛋白1∶400,pH7.5处理36 h),再用亲和柱色谱纯化制备非融合的rIL-24。MTT法和形态学观察分析rIL-24体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。结果重组工程菌以包涵体形式表达出相对分子质量约为35 000的融合蛋白。包涵体经洗涤、溶解及二步纯化得到纯度大于95%的Trx-IL-24。融合蛋白用肠激酶酶切之后,经亲和色谱制备得到纯度大于98%的非融合蛋白rIL-24。rIL-24显著诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡(P<0.05),而对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。结论IL-24基因在E.coli中高效表达,并获得高纯度、在体外明显诱导乳腺癌细胞凋亡的非融合蛋白rIL-24,预示其具有肿瘤治疗应用的前景。

重组人白细胞介素24蛋白对胰腺癌细胞生长的影响

目的构建人白细胞介素24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化后的IL-24融合蛋白导致人胰腺癌细胞(Panc-1)生长抑制的作用。方法用限制性内切酶从质粒pET30b-IL-24中酶切获取人IL-24cDNA片段。并将该片段与pET42a原核表达载体基因重组,在大肠杆菌中实现重组基因的表达,提取并纯化rhIL-24蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和Westernblot对表达产物进行鉴定。以不同浓度的重组蛋白IL-24与胰腺癌细胞Panc-1、正常肝胚细胞CCC-HEL-1共培养48h,同时设立相应浓度梯度的HIS-GST融合蛋白组对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的生长抑制情况。结果酶切结果证实,成功构建了pET42a-IL24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达。rhIL-24蛋白以浓度依赖性的关系抑制Panc-1细胞的生长,抑制率明显高于HIS-GST蛋白。结论rhIL-24蛋白对胰腺癌细胞Panc-1生长有抑制作用。

SA/hIL24双功能融合蛋白的制备及其生物学活性的鉴定

目的:制备链亲和素标记的人白细胞介素24融合蛋白(SA/hIL24),并鉴定其生物学活性。方法:通过RT-RCR扩增hIL-24基因序列,构建pET24a-SA-hIL24和pET21a-hIL24-SA重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达的融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析和凝胶过滤层析纯化、透析复性。MTT法检测融合蛋白对肿瘤细胞的生长抑制作用,流式细胞仪分析融合蛋白对已生物素化的小鼠膀胱癌MB49细胞的锚定修饰效率。结果:成功构建两种融合蛋白的重组表达质粒,在大肠杆菌中实现高效表达,表达量分别占菌体总蛋白的20%和35%,二次纯化后SA/hIL24融合蛋白纯度可达95%以上。SA/hIL24融合蛋白可高效结合至已生物素化的MB49肿瘤细胞表面(表面锚定修饰率大于90%),hIL24-SA融合蛋白可以剂量依赖的方式抑制Hela细胞的生长,而SA-hIL24融合蛋白对Hela细胞没有明显的抑制生长作用。结论:SA/hIL24融合蛋白的制备为hIL-24表面锚定修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供了基础。

人白介素24融合载体的构建、突变纠正和表达优化

以武汉大学病毒学国家重点实验室保存的白介素24(IL-24)为模板,构建原核表达载体pET28a-IL-24,转化大肠杆菌DH5α,挑取单克隆,测序结果显示:在IL-24第18位A→G,21位C→T,412位G→A,18位和21位的突变没有使该位上的氨基酸发生改变,而412位的突变导致了该位点上的氨基酸发生改变——由丙氨酸A变为苏氨酸T。通过设计突变引物,二次PCR将其纠正,转化大肠杆菌BL21。通过改变诱导剂IPTG的浓度、诱导时间和诱导温度摸索最佳诱导条件,SDS-PAGE、Western blot检测显示有融合蛋白6hisIL-24表达。结果表明:通过二次PCR成功构建了IL-24原核表达载体,表达产物主要以包涵体的形式存在,最佳诱导温度为28℃,最佳诱导剂浓度为1mmol/L,最佳诱导时间是8h。

TRAIL_(114～281)-IL-24融合蛋白的原核表达及其体外抗肿瘤细胞活性

目的原核表达肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)114～281肽和人白细胞介素-24(Interleukin-24,IL-24)融合蛋白,并检测其体外抗肿瘤细胞活性。方法以人外周血单个核细胞总RNA为模板,PCR扩增TRAIL114～281和IL-24基因,经T4DNA连接酶连接成融合基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a/TRAIL114～281-IL-24,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白TI经层析法纯化后,进行Western blot分析,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,caspase3活性检测试剂盒检测其对不同肿瘤细胞caspase3活性的影响。结果重组表达质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;TI融合蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度可达95%,且可与鼠抗人IL-24抗体发生特异性反应;经复性的蛋白能明显抑制人宫颈癌上皮细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7增殖,并显著提高肿瘤细胞的caspase3活性。结论已在大肠杆菌中表达了TRAIL114～281-IL-24融合蛋白,其具有诱导部分肿瘤细胞凋亡的活性。