牛传染性鼻气管炎病毒gB ELISA抗体与中和抗体相关性分析

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)是牛传染性鼻气管炎(IBR)的病原体,常引起流产和呼吸道感染等综合征,给养牛业造成了巨大经济损失。gB作为IBRV中最保守的抗原蛋白,是IBRV诊断的重要靶蛋白。为探究牛gB–ELISA抗体水平与VNT效价的相关性,本研究采用阻断ELISA和VNT两种不同的方法对某一牛场50份血清进行IBRV gB ELISA抗体检测和中和抗体测定。gB ELISA结果显示,阳性血清19份,阴性血清31份;中和抗体结果阳性17份,阴性33份。通过统计学相关系数分析,gB抗体阻断率和中和抗体效价值的相关系数为1.0,从而说明IBRV gB ELISA抗体和中和抗体呈较强的正相关。本研究为使用IBRV gB ELISA抗体水平评估牛群中IBRV抗体保护效果提供理论依据。

猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法的建立

用纯化的猪伪狂犬病病毒gB重组蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的gB-ELISA方法。最佳反应条件为:抗原包被浓度为3.15μg/mL,待检血清稀释度为1∶40。该方法对猪圆环病毒病、猪瘟、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征(猪蓝耳病)、猪乙型脑炎、猪布氏杆菌病5种疾病阳性血清和SPF猪阴性血清检测呈阴性反应。批间、批内试验变异系数均不超过8%。用该方法与HerdChek ELISA试剂盒同时对119份血清进行了平行检测,其相对敏感性、特异性和符合率分别为:75%、80.7%和79%。试验结果表明:猪伪狂犬病血清抗体gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性,且重复性好,可用于猪伪狂犬病毒血清抗体检测。

伪狂犬病病毒gB基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立评价伪狂犬病疫苗免疫效果的方法,应用PCR方法扩增gB基因的主要抗原表位区序列,大小为768bp,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后克隆至pET-32a(+)载体,构建重组表达质粒pETgB768,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后,通过IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测融合蛋白的表达情况及其反应原性。用纯化的gB768蛋白作为包被抗原建立间接gB768-ELISA检测方法,试验结果表明,该方法具有良好的敏感性、特异性、重复性。用该方法检测128份临床送检猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果进行比较,符合率为93.8%。该方法的建立为猪伪狂犬病疫苗免疫效果的评估奠定了基础。

伪狂犬病病毒gB和gE蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究利用PCR扩增伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株gB基因核心抗原区和闵A株gE基因核心抗原区,构建了重组质粒pET-32a-gB和pET-32a-gE,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE分析表明,pET32a-gB蛋白分子量约为44 kDa,pET32a-gE蛋白分子量约为41 kDa。分别以gB和gE重组蛋白作为包被抗原,建立了PRV抗体间接ELISA检测方法。该方法中重组蛋白仅与PRV阳性血清发生特异性反应,检测敏感性可达到1∶1600,批内重复性和批间重复性变异系数均小于10%。本研究建立的间接ELISA方法可用于PRV抗体的监测,鉴别疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,有利于猪伪狂犬病净化工作。

3种猪伪狂犬病gB抗体ELISA检测试剂盒的比较

采用3种猪伪狂犬病gB抗体ELISA检测试剂盒检测121份血清样品,对检测结果进行Kappa一致性检验。结果显示:3种gB抗体检测试剂盒都具有很好的重复性,两两之间检测结果的符合率达80%以上,Kappa值>0.6,表明3种检测试剂盒具有较好的重复性和一致性。

基于gB蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法的建立

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotrachetitis virus,IBRV)的早期快速检测方法,并能判定免疫后是否再次发生感染,本研究利用原核表达IBRV gB蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot检测gB蛋白的表达,并初步建立基于gB蛋白检测IBRV的间接ELISA方法。结果表明:1)对IBRV标准阳性血清,本试验方法的最低检测限度为1∶4096,说明建立的gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性。2)该方法对其他4种常见的牛疫病阳性血清检测均为阴性,不存在交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。3)在对200头牛的临床样品的检测中,该方法与IDEXX(IBRV gB X3)抗体检测试剂盒符合率高达97.5%。综上,本研究建立的gB-ELISA检测方法敏感性高,特异性好,该方法为开发一种在感染早期快速对疾病进行诊断,并可以判定疫苗免疫后是否再次发生IBRV感染的试剂盒奠定基础。

某规模化猪场猪伪狂犬gE和gB抗体的检测与分析

[目的]了解龙岩市某规模化猪场猪伪狂犬野毒感染状况和免疫抗体水平.[方法]采用ELISA法对2010～2013年该场采集的种猪和育肥猪群的血清样品共1 217份进行猪伪狂犬野毒（gE）抗体和免疫（gB）抗体检测.[结果]种猪与育肥猪猪伪狂犬野毒总样品阳性率分别为13.5％和28.4％,其中60～ 100日龄的育肥猪总样品阳性率为5.2％,100 ～210日龄的总样品阳性率为42.1％;种猪伪狂犬免疫抗体总样品阳性率分别为92.2％,60 ～160日龄的育肥猪猪伪狂犬免疫抗体阳性率呈波动变化,血清样品总阳性率为50％.[结论]该猪场育肥猪群野毒感染率较种猪群高,且100日龄以后的育肥猪群野毒感染率较高,种猪群的免疫抗体水平高于育肥猪群,80～130日龄育肥猪免疫抗体水平较低.

猪伪狂犬病毒gB基因在大肠杆菌中的分段表达

目的分段表达伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)gB基因,用于PRV疫苗免疫抗体评估试剂盒研究。方法分析gB抗原表位,设计4对特异性引物,从PRV新疆分离株中扩增gB基因的4个片段,分别命名为gB-1、gB-3、gB-4和gB-5基因,克隆到pGEM-T-easy载体并测序。再将4个gB基因片段融合到pGEX-6P-1原核表达载体中,表达并纯化。Western Blotting进行重组蛋白的抗原性检测。以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,检测猪血清临床样品。结果构建的4种表达质粒均可在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,表达分子量分别为75.05、53.86、49.96和49.72×103Da,其中gB-3、gB-4和gB-5表达量较高,表达产物主要存在于包涵体中。Western Bloting鉴定显示,4种融合蛋白均可被猪伪狂犬阳性血清特异识别。以gB-3、gB-4和gB-5建立的ELISA方法与IDEXX公司的gB-ELISA试剂盒符合率分别为40.9%、81.8%和81.8%。结论本研究成功表达了PRV的gB-1、gB-3、gB-4和gB-5重组蛋白,gB-3、gB-4和gB-5表达量较高;其中以gB-4和gB-5建立的间接ELISA方法与IDEXX公司的符合率较高。

生猪伪狂犬病毒gB抗体与中和抗体的相关性分析

为探索生猪伪狂犬病毒gB–ELISA抗体水平的高低与中和抗体效价的相关性,运用酶联免疫吸附测定(ELISA)法对177份生猪血清进行了伪狂犬病毒gB抗体的检测,同时,用中和试验对上述血清样品进行了伪狂犬病毒中和抗体的测定。试验结果通过生物统计学分析,gE抗体阴性血清的g B抗体平均S/P值和中和抗体效价(SN效价)倒数平均值的相关系数为0.926,说明g B免疫抗体S/P值与其中和抗体效价有很好的相关性。中和抗体水平的高低一般与免疫保护力呈正相关,研究结果表明gB–ELISA抗体水平可以用来评估生猪对当前流行PRV毒株的相对免疫保护力。

GB病毒B型(GBV-B)感染的临床与免疫病理研究

目的自从建立起甲、乙、丙、丁、戊5种肝炎病毒的病原学诊断之后,仍有少部分肝炎患者的病因得不到明确,因此不少学者试图探索是否还有新型肝炎病毒的存在,并进行了大量的流行病学和实验诊断的研究,认为的确存在可经肠道外传播并引起人类肝炎的致病因子.1995年 Simons et al 成功地克隆出2株黄病毒 RNA 序列,称之为 GBV-A,GBV-B.继而从一名西非患者血清中克隆出另一黄病毒 RNA 序列,称之为 GBV-C.1996年初美国另一研究小组从一名慢性输血后肝炎患者血清中克隆出一株黄病毒 RNA 序列,称之为 HGV.进一步的研究后认为 GBV-C,HGV 为同一病毒的不同分离株.动物实验发现,GBV-B 可单独引起动物发病,而 GBV-A 单独感染时未能引起发病.本文以此为依据,对 GBV-B 感染者的临床与免疫病理加以研究,试图探讨 GBV-B 对人体肝脏的致病性及其在人体内的分布状态.方法根据 GBV-B NS5区的核苷酸和氨基酸序列,通过计算机软件对其抗原位点进行了预测,并分析其亲水性、键流动性、电荷状态及抗原表位分布等特性,合成一条30个氨基酸多肽.探讨合成肽最佳包被量之后,成功地建立了间接 ELISA 法,用来检测抗-GBV-B.应用此方法检测各型肝炎及其他高危人群血清标本1286份.同时应用 RT-PCR 检测血清中 GBV-B RNA及免疫组化检测肝炎患者肝组织相关病毒抗原.结果经鉴定合成肽纯度在95%以上,氨基酸分析的实际值与理论值基本一致.将合成肽与牛血清清蛋白(BSA)偶联免疫白兔获得高效价抗-GBV-B NS5区的多克隆抗体(PcAb).批内、批间变异系数分别为6.06%和7.65%(均<10%);中和抑制试验结果证明我们建立的 ELISA 法具有较好的特异性.血清抗-GBV-B 检测结果表明各型肝炎患者血清抗-GBV-B 阳性率为10.56%;其中非甲～非戊型肝炎患者血清抗体阳性率为8.57%;肝炎高危人群如献血员、血液透析者及静脉药瘾者血清抗-GBV-B 阳性率分别为2.90%,8.62%及13.44%.随机抽取抗-GBV-B 阳性和抗-GBV-B 阴性血清标本各32例进行RT-PCR 检测 GBV-B RNA,结果64例均为阴性.应用抗-GBV-B 多克隆抗体为试剂,对42例肝炎患者肝组织进行免疫组化研究,均未检测出 GBV-B 相关抗原.结论提示 GBV-B 可能不是人类肝炎病毒,对人体肝脏的致病性轻微,其抗体在不同人群中出现可能是一种短暂的感染,其意义有待进一步研究.

运用双重PCR和ELISA法对云南部分地区PRRSV和PRV的检测分析

为了解云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)的流行情况,试验采集云南省不同地区具有呼吸道症状的猪血清样品174份,首先建立PRRSV-GP基因和PRV-gB基因的双重PCR检测方法,然后运用建立的双重PCR方法和ELISA抗体检测试剂盒对PRRSV-GP和PRV-gB的阳性率及抗体水平进行检测分析。结果表明:试验建立了最低检测限度分别为1.48 ng/μL和0.67 ng/μL的PRRSV-GP和PRV-gB的双重PCR检测方法;单一PCR和双重PCR检测的PRRSV-GP阳性率为45.4%(79/174),PRV-gB阳性率为75.86%(132/174),混合检出率为5.17%(9/179);ELISA检测试剂盒检测的gE阳性率为0(0/174),PRRSV和PRV-gB的阳性率结果与单一PCR、双重PCR检测结果一致。说明试验构建的双重PCR方法有良好的敏感性和特异性;云南省部分地区PRRSV抗体阳性率低且免疫效果较差,PRV抗体阳性率相对较高且免疫效果良好。

伪狂犬病毒gB基因的研究进展

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)主要感染猪,能够引起感染动物的死亡和流产,给世界养猪业带来了严重危害。随着分子生物学的发展,伪狂犬病毒的研究取得了显著进展。综述了PRV的主要保护性抗原基因g B的结构特点和功能研究进展以及其编码的糖蛋白g B在PRV疫苗研究和伪狂犬病防控研究中取得的进展。

猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA的建立与应用

利用伪狂犬病病毒（PRV）ZJ01毒株重组gB蛋白及其对应的HRP标记的单克隆抗体,旨在建立一种检测伪狂犬病病毒gB抗体的阻断ELISA。对ELISA反应条件进行了优化,具体为：包被抗原的质量浓度为0.5 g/mL;待检血清的稀释比例为1∶1,孵育条件是37℃作用1 h;酶标单抗的稀释度为1∶15 000,作用时间为37℃0.5 h。ELISA结果的判定标准为：血清样品阻断率PI≥28.67%时判为阳性;PI≤18.27%时判为阴性;18.27%〈PI〈28.67%时判为可疑。该ELISA能特异性地识别PRV阳性血清,而与PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV阳性血清无交叉反应性。ELISA的重复性试验表明,批间和批内的变异系数均小于10%。比较试验结果表明,该ELISA的相对敏感性和特异性分别为80.9%和96.4%,与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率为85.1%。用建立的此ELISA对田间采集的535份猪临床血清样品进行了检测,结果显示,PRV抗体阳性率达61.87%。综上所述,本试验建立的猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA具有特异、简单、快速的优点,为建立标准化的检测试剂盒奠定了基础。

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

采用PCR方法从牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)Bartha Nu/67株扩增出完整的gB基因编码区,将其克隆到pGEM-T Easy载体。根据抗原性将gB基因分成3段,分别克隆到原核表达载体pET-32a中,构建了重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析。结果显示,目的蛋白均获得了高效表达,均以包涵体形式存在,纯化后目的蛋白的纯度在90%以上。Western-blot和ELISA分析表明,重组蛋白pET-gBⅢ的反应原性最好。以纯化的pET-gBⅢ为诊断抗原包被酶标板,建立了检测BHV-1抗体的间接ELISA方法。用该间接ELISA与法国IDEXX公司的IBR抗体检测试剂盒对临床样品进行平行检测,结果二者的总符合率为93.8%。表明建立的gBⅢELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。

猪巨细胞病毒gB基因优势抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

扩增了猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因的优势抗原表位区,将构建成功的gB基因优势抗原表位区原核表达重组质粒(pET32a-gB)转化入表达菌Rosetta(DE3)中进行表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了一种检测PCMV抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA检测方法进行了优化。结果显示,最佳抗原包被浓度为1.9μg/mL,最佳血清稀释度为1∶160,二抗最佳稀释度为1∶10 000;当样品D450nm≥0.26时判为阳性,当样品D450nm<0.215时判为阴性,介于两者之间时判为可疑。用该间接ELISA方法对138份PCMV阴性血清与240份PCMV阳性血清进行检测的结果显示,它的特异性为97.83%,敏感性为97.9%,变异系数均小于10%。用该ELISA方法和Western-blot对184份临床样品进行检测,结果二者的符合率为92.4%。结果表明,该间接ELISA方法简便快捷,具有良好的特异性、敏感性及重复性,适用于对PCMV抗体的大规模检测。

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核表达产物单抗的制备

用大肠杆菌 BL2 1表达了马立克氏病病毒 ( MDV)强毒 GA株的囊膜糖蛋白 B( g B)基因 ,通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS- PAGE)分离表达蛋白条带 ,切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验 ( ELISA)和间接免疫荧光试验( IFA) ,得到 1株 GA株阳性的单克隆抗体杂交瘤细胞株 7C8。该单抗腹水的 ELISA效价为 1∶ 2 1 2 ,IFA效价为 1∶ 80 0 ,与 MDV不同致病型毒株 CVI988、GA、RB1 B、MD1 1、6 48A株感染的鸡胚成纤维细胞 ( CEF)均呈IFA阳性。 1∶ 1 0 0稀释时与 GA感染的 CEF在斑点酶联免疫吸附试验 ( dot- EL ISA)中呈阳性。

大中型猪场猪伪狂犬病抗体检测与分析

为了解大中型猪场猪伪狂犬病免疫抗体水平,采用ELISA方法对辽宁3个区域大中型猪场共7个场采集猪血清样品共270份进行猪伪狂犬病gE抗体和gB抗体检测。结果显示:猪伪狂犬病gE抗体和gB抗体的总阳性率分别为15.9%和85.9%。其中区域一、区域二、区域三猪伪狂犬病gE抗体阳性率分别为21.8%、0和23.8%,猪伪狂犬病g B抗体阳性率分别为85.5%、91.3%和81.3%。结果表明:大中型猪场的免疫措施得当,免疫效果明显,但还存在感染的猪只。区域一和区域三所采样的大中型场中均有不同程度的野毒感染,区域二的野毒感染率和免疫抗体水平均优于其它两个地区。

规模化猪场伪狂犬病净化方案应用效果的研究

猪伪狂犬病被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病,在我国一些大型规模化猪场普遍存在,直接或间接影响我国养猪业的健康发展,该病已被列入《国家中长期动物疫病防治规划》(2012-2015年)重点优先防制和净化的疫病。本研究是在应用猪伪狂犬病gE/gB-ELISA监测方法(GB/T 18641-2002)进行规模化猪场猪伪狂犬病抗体监测区分PRV野毒与疫苗毒感染的基础上,配合猪场从PRV病原学检测区分PRV野毒与疫苗毒的多重PCR(mPCR)方法和生物安全措施的建立,对贵州某规模化猪场伪狂犬病进行净化方案应用效果进行研究。先后开展了对安顺某规模化猪场血液进行了4次PRV-gB/gE ELISA抗体监测及PRV抗原检测,共监测样品为1 837份,检测结果表明,安顺某规模化猪场在开展伪狂犬病净化工作之后猪PRV-gB抗体水平均达到90%,PRV-gE抗体阳性率及PRV抗原阳性率均降为0,表明所开展的净化方案对规模化猪场猪伪狂犬病的净化工作有明显的效果,该研究可为规模化猪场伪狂犬病的净化提供参考。

闽北地区猪伪狂犬病抗体检测分析

为了解猪伪狂犬病在闽北地区的流行情况,整理并分析2015年度血清抗体检测数据。采用ELISA检测方法对闽北地区45个规模化猪场进行检测分析,通过检测样品血清中伪狂犬病g E抗体和g B抗体的水平进行结果判定。结果显示:送检的45个规模化猪场,伪狂犬病g E抗体阳性场达25个,猪场阳性率达55.6%;共检测1 304份血清,其中伪狂犬病g E抗体阳性213份、可疑24份、阴性1 067份,抗体阳性率达20.6%。从伪狂犬病g E抗体阴性猪场抽检猪伪狂犬g B抗体380份,g B抗体阳性258份,猪群伪狂犬病抗体保护率仅有67.9%。

三种猪伪狂犬病抗体监测方法的比较

本试验以伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-k61制备灭活疫苗,接种PRV抗体阴性猪,然后用g B ELISA抗体检测法、中和抗体指数法和中和抗体法进行效果监测。结果显示:三种方法都能检测到疫苗接种后发生了免疫应答,但以中和指数值和中和抗体值来表示猪群免疫效果更为准确,g B ELISA抗体阳性率不能作为群体免疫效果指标。