单纯疱疹病毒II型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pcDNA3/gD,并在体外COS-7细胞中进行表达。方法:体外PCR扩增出gD糖蛋白基因,克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后,转染COS-7细胞,用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果:构建了pcDNA3/gD真核表达质粒,经原位ELISA证实,转染COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合,证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论:构建的重组真核表达质粒pcDNA3/gD能够在COS-7细胞中表达。

HSV-gB、gD糖蛋白重组串联抗原表位蛋白的表达及鉴定

目的制备HSV-gB、gD蛋白串联表位重组蛋白,为单纯疱疹病毒(HSV)疫苗的研制提供新型抗原蛋白以及新的抗原制备方法。方法应用生物信息学软件laser gene DNASTAR分析HSV1-gB、gD和HSV2-gB、gD蛋白的抗原表位。选取9个表位,设计并合成表位串联重组蛋白编码基因X,构建其原核细胞表达重组体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达该重组表位蛋白X,Western blot法(抗His标签)鉴定重组蛋白。结果构建了HSV-gB、gD蛋白串联表位重组蛋白X的原核表达体,在BL21菌中表达了X蛋白,Western blot法(抗His标签)鉴定了重组蛋白X。结论建立了制备HSV-gB、gD蛋白重组抗原表位蛋白的方法,为HSV疫苗的研制提供了可能的新型抗原蛋白。

抗牛传染性鼻气管炎病毒囊膜gD糖蛋白的单链抗体在昆虫细胞中表达及活性检测

为了获得具有生物学活性的牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD蛋白特异性单链抗体,试验采用PCR方法扩增杂交瘤细胞的cDNA单链抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,通过重叠延伸PCR及Linker序列获得完整的单链抗体基因,将单链抗体基因克隆至杆状病毒载体pFB-LICBse中,构建重组转移载体pFB-VH-VL,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒rBacmid-VHVL,将重组杆粒rBacmid-VH-VL转染至Sf9细胞中获得携带单链抗体基因的重组杆状病毒。该重组杆状病毒在Sf9细胞中表达了分子质量约为30ku的单链抗体蛋白。Western blotting结果显示,重组单链抗体蛋白能被His标签抗体特异性结合,也能特异性结合gD蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,该单链抗体蛋白能够识别感染牛肾细胞MDBK中的IBRV。本研究在昆虫细胞中成功表达了具有识别IBRV的gD蛋白特异性单链抗体,为牛传染性鼻气管炎的诊断与治疗奠定了基础。

gD糖蛋白基因表达质粒pcDNA3Kan-gD的构建及其在Hela细胞中的表达检测

目的利用半定量RT-PCR技术及免疫荧光技术分析构建的单纯疱疹病毒gD糖蛋白基因真核表达质粒在Hela细胞中的瞬时表达情况。方法构建并提纯重组的真核表达质粒pcDNA3Kan-gD,转染培养的Hela细胞,采用半定量RT-PCR技术及免疫荧光技术检测外来转染的gD基因在Hela细胞中的瞬时表达。结果转染了pcDNA3Kan-gD重组质粒的Hela细胞RNA中能够扩增出gD基因的特异性条带,免疫荧光技术分析结果显示,转染了pcDNA3Kan-gD重组质粒的Hela细胞中能检测到特异性绿色荧光。结论真核表达质粒pcDNA3Kan-gD能够在Hela细胞中瞬时表达,有可能成为抗单纯疱疹病毒DNA疫苗候选物之一。

牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gB和gD的研究进展

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是牛的重要传染病,临床以呼吸道症状为主,伴有结膜炎、乳腺炎、流产等症状。其病原是牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV),又称牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus 1,BHV-1),共编码30~40种结构蛋白,其中11种为囊膜糖蛋白。糖蛋白在病毒吸附、侵入宿主细胞的过程中发挥重要作用。糖蛋白gB对病毒侵入宿主细胞、在细胞间扩散及复制至关重要;糖蛋白gD在病毒复制、传播和感染机制方面作用重大,具有良好的免疫原性,是诱导产生中和抗体的主要糖蛋白。对gB、gD的研究不仅可从蛋白层面解析病毒侵染机制,还能够为牛传染性鼻气管炎的临床诊断和预防提供理论依据。本文针对牛传染性鼻气管炎病毒的主要糖蛋白gB、gD的研究结果进行综述,分析其生物学功能以及在疫苗和诊断方面的应用,以期为牛传染性鼻气管炎侵染机制和防控提供参考。

猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白gD主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本试验通过PCR方法以猪伪狂犬病病毒SD株的基因组DNA为模板扩增得到了含gD主要抗原表位编码区的片段,将该PCR产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游。构建的重组质粒pET-gD经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量约为45.2ku,主要以包涵体形式存在。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该纯化蛋白能与猪伪狂犬病病毒抗体阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原反应性,可以作为猪血清伪狂犬病病毒抗体诊断用抗原。

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gD基因的表达及基因免疫

构建了 2个利用人类巨细胞病毒 ( HCMV)的启动子启动表达伪狂犬病病毒 Ea株糖蛋白 g D基因的真核表达质粒 p CIDI和 pc DDI,体外转染 BHK-2 1细胞 ,用间接免疫荧光法检测 ,证实糖蛋白 g D在细胞中得到表达。用表达质粒 p CIDI和 pc DDI作为核酸疫苗免疫 BALB/c小鼠 ,ELISA检测小鼠血清中抗伪狂犬病病毒的抗体 ,结果其滴度为 1∶ 1 2 8～ 1∶ 51 2。初步证实 ,用 g D基因作为核酸疫苗免疫动物 。

猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD在谷氨酸棒杆菌中的表达及优化

为在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中进行猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD(Glycoprotein gD of porcine pseudorabies virus)的可溶性表达,通过启动子、底盘菌株和发酵条件的优化,提高gD在C.glutamicum中的表达量,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot方法进行表达产物的分析与鉴定,用镍离子亲和层析柱纯化产物。SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,gD在谷氨酸棒杆菌表达系统获得正确表达,相对分子质量约4.5×104,可与猪抗gD阳性血清特异性反应。摇瓶培养下最优发酵条件为诱导温度30℃,诱导时长24 h,优化后gD质量浓度可达到517 mg/L。

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的截短表达与活性检测

经生物学软件DNAStar分析,以牛传染性鼻气管炎病毒(Banha Nu/67)基因组DNA为模板,PCR扩增gD基因943bp的片段,将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到部分可溶表达的重组蛋白。用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.852mg/mL,纯度为85.2%。Westem blot、间接ELISA检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。

牛疱疹病毒糖蛋白D的结构特点及在疫苗学中的应用

牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesviruses 1,BHV-1)和牛疱疹病毒5型(Bovine Herpesviruses,BHV-5)是引起牛呼吸道疾病的2大重要病原,其膜糖蛋白D(Glycoprotein D,gD)是病毒粒子的重要组成成分,在疱疹病毒的发病机理方面发挥重要作用。该文介绍了BoHV-1、BoHV-5的结构和功能特征,以及它在病毒进入宿主细胞和与宿主细胞受体相互作用中的作用,讨论了gD与宿主免疫系统的相互作用,并结合该蛋白的结构和功能特点,阐述了其在新疫苗设计中的应用。

牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株gD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从感染牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株的MDBK细胞中扩增gD基因,将之克隆到pGEM-T Easy载体。根据对gD基因的结构分析,设计合成3对引物,以获得的克隆质粒为模板,PCR扩增gD胞外域基因,将之分别亚克隆到pGEX-4T-2和pET-32a表达载体中构建成表达质粒pGEX-4T-gDQ、pGEX-4T-gDQB、pGEX-4T-gDHB和pET-gDQ、pET-gDQB、pET-gDHB,利用上述质粒分别转化大肠杆菌BL21和BL21(DE3),IPTG诱导后SDS-PAGE检测,结果pGEX-4T-gDQ、pGEX-4T-gDQB、pGEX-4T-gDHB和pET-gDQ四个表达质粒出现表达且符合预期大小,Western blot表明表达产物均有抗原性。

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因截短表达及其抗血清制备

gD糖蛋白是IBRV感染细胞的主要分子,在病毒吸附和侵入宿主细胞中发挥着重要作用。利用IBRV基因组DNA为模板,经生物学软件DNAstar分析主要抗原区,PCR扩增gD基因786bp片段,定向连接到pET32a(+)表达载体中,筛选阳性克隆转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达部分可溶的重组蛋白。Ni-NTA非变性纯化系统纯化蛋白,纯化的蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,利用间接ELISA法检测抗血清效价为1∶6400;同时以该血清进行血清中和病毒实验,中和指数为1∶640,显示该抗血清具有良好的抗病毒能力,为进一步开发牛传染性鼻气管炎(IBR)的诊断检测试剂和疫苗奠定了重要基础。

牛疱疹病毒1型洛精株gD基因的分子克隆及序列分析

根据已发表的牛疱疹病毒 1型 (BHV 1)P8 2株 gD基因的核苷酸序列设计了 1对特异性引物 ,对我国BHV 1洛精株 gD基因进行PCR扩增 ,并对其克隆、测序和分析。结果表明 ,gD基因的核苷酸长度为 12 5 1bp ,其编码 417个氨基酸 ;BHV 1洛精株gD与国外报道的P8 2株的 gD基因的核苷酸的同源性高达 99.92 % ,氨基酸的同源性高达 10 0 %。这说明BHV 1的

Ⅰ型单纯疱疹病毒gD基因片段的高效表达及抗原性分析

目的:获得高表达的I型单纯疱疹病毒(HSV)被膜糖蛋白gD(简称gD1)基因的工程菌。方法:通过计算机分析,筛选出疱疹病毒gD1中优势抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插入表达载体pTrxA内,转化大肠杆菌Rosetta,以异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析表达产物。结果:PCR扩增出约930bp的gD1编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变。所构建pTrxAgD1重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致。含有pTrxAgD1重组质粒的大肠杆菌Rosetta诱导后得到了高效表达,SDSPAGE显示表达产物约48kDa。免疫印迹结果表明表达产物具有较好的抗原性。结论:成功构建了pTrxAgD1表达质粒,实现了成熟gD1蛋白在大肠杆菌中的高效表达,表达产物具有好的抗原性。

单纯疱疹病毒1型糖蛋白gD的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达及纯化单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)糖蛋白D(glycoprotein D,gD)并制备多克隆抗体。方法双酶切pcDNA 3.1-HSV1-gD和pFastBacTM I质粒,gD基因克隆到pFastBacTM I载体,连接产物转化E.coli DH10Bac感受态细胞并鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD。将构建正确的重组杆粒转染Sf9细胞包装杆状病毒。杆状病毒经传代扩增后,诱导重组gD蛋白的表达,使用Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组gD蛋白,进行15%SDS-PAGE电泳鉴定并采用肽指纹图谱分析纯化的gD蛋白。将纯化的gD蛋白进行热稳定性试验检测其在不同缓冲液条件下的稳定性。用重组gD蛋白免疫小鼠,利用ELISA法检测血清抗体滴度。结果成功构建重组质粒pFastBacTM I-gD,转化E.coli DH10Bac感受态细胞后,经蓝白斑筛选鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,鉴定正确的重组质粒感染Sf9细胞,包装出重组杆状病毒,获得滴度为8×108 pfu/ml的P3代杆状病毒。重组杆状病毒再次感染Sf9细胞能够表达高纯度可溶性的重组gD蛋白。不同缓冲液条件下重组gD蛋白稳定性良好。用gD蛋白免疫小鼠,获得ELISA效价为1×105的多克隆抗体。结论成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,表达的HSV-1 gD蛋白稳定及免疫原性良好,制备的抗gD蛋白多克隆抗体滴度高,为HSV-1的亚单位疫苗的制备鉴定了基础。

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D胞外区的真核表达及生物学活性分析

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)包膜糖蛋白D(glycoprotein D,gD)是HSV的结构蛋白之一,具有重要抗原表位,是目前疫苗研究的热点。为了分离纯化HSV gD1糖蛋白胞外区片段并对其生物学活性进行分析,本研究将化学合成的gD1胞外区基因片段克隆至真核表达载体pCEP4,重组质粒转染HEK293细胞进行瞬时表达,产物经Western blotting检测后用亲和层析法进行分离纯化,ELISA检测其抗原性。以纯化的重组蛋白作为抗原免疫小鼠,ELISA测血清特异性抗体效价以评价其免疫原性。构建的重组质粒经测序显示基因序列完全正确。表达产物的Western blotting分析发现,在相对分子量约46kDa处有外源蛋白表达,与预期蛋白带一致。用Ni柱得到了纯化的重组gD1蛋白,ELISA检测显示其具有良好的抗原性,免疫小鼠7周后血清中抗体效价达到5×103。重组gD1蛋白的抗原性及免疫原性分析为HSV检测试剂和基因重组亚单位疫苗的研制提供了实验依据。

重组病毒BoHV-1 gG^-/tk^-/gD^+和BoHV-1 gG^-/tk^-/gD5^+的兔体内安全性和免疫原性

【目的】牛传染性鼻气管炎由BoHV-1感染引起,我国对该病的防控尚缺乏商品化标记疫苗,本实验室前期成功研制了BoHV-1 gG^-/tk^-基因缺失疫苗,并通过将BoHV-1和Bo HV-插入BoHV-1 gG^-/tk^-的tk位置,构建了重组病毒BoHV-1 gG^-/tk^-/g D+和BoHV-1 gG^-/tk^-/g D5+。本研究的目的在于评价该重组病毒在兔体内5的免疫原性最好的糖蛋白g D的胞外区序列分别的安全性和免疫原性及对BoHV-1保护力和Bo HV-5的交叉保护力,以期开发出更为有效的牛传染性鼻气管炎标记疫苗。【方法】选用30只日本大耳白兔并随机分成6组,鼻腔接种和攻毒。通过临床症状观察、体温测量和鼻腔排毒检测进行安全性评估。接种28 d后分别使用wt BoHV-1和wt Bo HV-5对兔体进行攻击,并通过临床症状观察、体温测量、鼻腔排毒、病理组织学和组织病毒的分离鉴定进行保护力研究。使用间接ELISA、中和实验和外周血单核细胞的增殖水平对重组病毒免疫原性进行评估。【结果】接种BoHV-1 gG^-/tk^-/g D+和BoHV-1 gG^-/tk^-/g D5+后兔体均未出现显著临床症状,无鼻腔排毒现象,并且肺组织未分离到病毒;BoHV-1 gG^-/tk^-接种组有一只兔肺组织分离到病毒。攻毒后,BoHV-1 gG^-/tk^-/g D+和BoHV-1 gG^-/tk^-/g D5+可以减少临床症状、鼻腔排毒并维持正常肺组织形态,表现为对BoHV-1的保护力以及Bo HV-5的交叉保护力提高。与BoHV-1 gG^-/tk^-相比,BoHV-1 gG^-/tk^-/g D+和BoHV-1 gG^-/tk^-/g D5+免疫诱导更高水平的中和抗体、ELISA抗体以及PBMC增殖。【结论】BoHV-1 gG^-/tk^-/g D+和BoHV-1gG^-/tk^-/g D5+安全性良好,同时,与BoHV-1 gG^-/tk^-相比,免疫原性得到提高。