猪伪狂犬病病毒TK／gE双基因缺失株PRV／TK^-／gE^-的构建及其生物学特性

为了构建伪狂犬病病毒新兴株(PRV-XX)TK/gE双基因缺失的重组病毒,利用PCR从PRV-XX株基因组分别扩增gE基因两侧序列LgE和RgE,将LgE和RgE克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-gE/HEK;进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到质粒中,构建转移质粒pUC19-gE/EGFP;先用构建好的pUC19-TK/EGFP质粒与PRV-XX基因组共转染BHK21细胞,噬斑筛选纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;再用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑筛选纯化获得重组病毒PRV/TK-。在此基础上,用同样方法获得重组病毒PRV/TK-/gE-/EGFP和PRV/TK-/gE-。重组病毒PRV/TK-/gE-的生物学特性研究结果表明:TK/gE缺失稳定,30代次内未见缺失位点变化;TK/gE缺失后,重组病毒PRV/TK-/gE-毒力是亲本毒株PRV-XX株的1/48,但不影响其在ST细胞上的增殖;PRV/TK-/gE-对猪安全有效,其最小免疫剂量为105.0 TCID50,免疫水平与某进口伪狂犬病疫苗相当。

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE^-/gI^--EGFP^+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE^-/gI^-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。