PRV闽A株gE基因抗原编码区片段在昆虫细胞中的表达研究

伪狂犬病病毒(PRV)糖蛋白E是一种在伪狂犬病的根除计划中具有重要作用的糖蛋白。将伪狂犬病病毒闽A株gE基因抗原编码区片段克隆到杆状病毒Bac＿to＿Bac系统表达载体pFastBacHTa中,获得的重组表达载体pFastBacHTa＿FS转化大肠杆菌DH10BAC感受态细胞后,得到的重组BacmidDNA在脂质体介导下转染粉蚊夜蛾Hi5细胞,通过细胞内同源重组,获得了含目的片段的重组病毒。此重组病毒感染Hi5细胞后72h,细胞总蛋白的SDS＿PAGE与Western＿Blot结果表明,gE基因抗原编码区片段在Hi5细胞中得到了正确表达,表达产物约35000,占细胞总蛋白的9 31%。溶解性分析显示该片段在Hi5细胞中为不可溶性表达。

利用真核表达载体构建表达PRV闽A株gE基因表位抗原编码区片段的重组质粒

根据伪狂犬病病毒闽A株gE基因表位抗原编码区的序列与两种真核表达载体pPICZaA、pAcGP6 7A的序列与特性分别设计了两对PCR引物。通过PCR方法扩增到了两端具不同酶切位点的gE基因表位抗原编码片段。将这 2个片段分别克隆到pPICZaA与pAcGP6 7A载体 ,转化大肠杆菌TOP 10菌株及XL1_Blue菌株 ,获得了含伪狂犬病病毒闽A株gE基因表位抗原编码区的重组质粒pPICZaA_FS与pAcGP6 7A_FS。序列测定结果显示两个重组质粒中插入片段的大小与方向均正确。

伪狂犬病病毒闽A株gE基因表位抗原编码区的克隆与序列测定

用PCR方法以伪狂犬病病毒闽A株的基因组DNA为模板扩增到了gE基因表位抗原决定域的编码区段。PCR产物连接到 pMD18-T载体后 ,转化大肠杆菌XL 1-blue菌株。重组质粒经测序并与GenBank中已登录的gE基因序列比较 ,确证含有PRV闽A株 gE基因的表位抗原编码区。此区段与PRVRice株相应区段的DNA序列同源性为 97 3% ,氨基酸序列同源性为 94 7%。

23株猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区序列差异分析

用RT PCR及测序获得了 17株猪瘟病毒 (HCV) 2 5 1bp的E2基因主要抗原编码区序列 ,经DNAstar软件对获得的 17株HCV及已发表的 6株HCV毒株序列进行了比较和分析 ,并构建了HCV遗传发生树。结果 ,这 2 3株与石门株的序列相比 ,所有毒株的碱基变化随机地分布于整个序列 ,无缺失和插入 ,其中变化较大的区域位于序列的 3′端。 2 3株HCVE2基因主要抗原编码区核苷酸及氨基酸同源性分别为 74.1%～ 10 0 %、79.7%～ 10 0 % ,其中 4株 2 0世纪 70～ 80年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为 76.3 %～ 86.2 %、81.1%～ 87.8% ,10株 2 0世纪 90年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为 75 .4%～ 10 0 %、79.7%～ 10 0 %。所绘制的遗传发生树分为 2个组群 (group) ,每个组群分为 2个亚组群 (subgroup) ,14株猪瘟 (HC)流行毒株在 2个组群中均有分布 ,2 0世纪 70～ 80年代分离的 3株 (75 % )在组 群 2 ,2 0世纪 90年代分离的 5株 (5 0 % )在组群

伪狂犬病病毒Ea株gE基因主要抗原区在巴斯德毕赤酵母中的表达

伪狂犬病病毒gE蛋白是一种重要的诊断抗原 ,可用于伪狂犬病根除计划中的鉴别诊断。为了获得大量的抗原 ,将编码gE主要抗原区域的基因片段插入毕赤酵母表达载体中 ,得到的重组表达载体转化GS1 1 5酵母 ,通过G41 8抗性筛选得到一株多拷贝的重组酵母 ,经甲醇诱导表达了截短的gE蛋白 ,并分泌到胞外。Westernblotting分析显示表达的蛋白大小为3 3kD。ELISA结果表明表达蛋白具有良好的抗原性 ,重组酵母的诱导培养上清不需纯化可直接作为抗原检测gE的抗体 。

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】为了区分伪狂犬病病毒疫苗免疫猪和自然感染猪,建立快速诊断的方法.【方法】利用PCR方法从伪狂犬病病毒中扩增出糖蛋白E(g E)基因的主要抗原表位区,用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒p ET-g E184,并转化至大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,用纯化后的g E184蛋白作为包被抗原,建立间接g E184-ELISA检测方法.【结果和结论】用该方法检测290份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为93.1%.

猪瘟病毒石门株不同代次E2基因主要抗原编码区序列差异分析

利用 RT- PCR及序列测定对猪瘟病毒石门株不同代次毒株 E2基因主要抗原编码区及同一代次不同年代主要抗原编码区序列进行了分析 ,结果所有毒株 E2基因主要抗原编码区序列呈现较高的同源性 ,石门株不同代次毒株 E2基因主要抗原编码区核苷酸及氨基酸同源性分别为 97.7%～ 10 0 %、97.3%～ 10 0 % ;同一代次不同年代主要抗原编码区序列核苷酸及氨基酸同源性均为 98.6 %～ 10 0 %。只有 3个代次毒株发生较小的变异 ,核苷酸及氨基酸呈现 1～ 3个碱基或氨基酸的变异 ,其他代次的毒株序列完全一致。初步证实了猪瘟病毒分子结构的遗传稳定性 。

山西猪伪狂犬病毒gE基因主要抗原区的遗传变异分析

根据Gen Bank中收录的PRV Becker株的gE基因序列,设计了合成1对引物,对山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE部分基因进行了PCR扩增,并进行克隆与序列分析。经测序,山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE部分基因核苷酸序列长度为997 bp,编码322个氨基酸。测序后对山西流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列和推导出的氨基酸序列与18株PRV参考株进行了遗传变异分析,结果显示,山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列与18株PRV参考株之间同源性为97.8%~100%,其中与YY株(湖南)、SC-1-2015株(四川)、HNXX2012株(湖北)、HN-DZ株(广东)及DL14-08株(长春)同源性最高,均为100%,与75V19株(比利时)同源性最低,为97.8%。山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因核苷酸序列推导的氨基酸序列与18株PRV参考株之间同源性为96.1%~100%,其中与YY株(湖南)、SC-1-2015株(四川)、HNXX2012株(湖北)、HN-DZ株(广东)及DL14-08株(长春)同源性最高,均为100%,与Rice(美国)同源性最低,为96.1%。山西PRV流行株包含主要抗原表位区的gE基因序列的遗传进化分析表明,山西PRV流行株属于2012年以来分离的PRV变异株群,与YY株和HNXX2012株亲缘关系较近,与欧洲和美洲分离株亲缘关系较远。

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中的表达与gE乳胶凝集鉴别诊断方法的建立

将伪狂犬病病毒 (PRV)Ea株 gE 基因主要抗原表位区段融合到原核表达载体 pET2 8b的T7启动子下游 ,构建成原核表达质粒 ,经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和Westernblot印迹分析 ,证实 gE 基因主要抗原表位区在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物具有抗原性 ,分子量为 38kD ,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理 ,复性产物致敏乳胶 ,并对抗原致敏浓度、致敏时间、致敏温度进行优化 ,建立了gE乳胶凝集试验 (gE -LAT)。该方法不仅能显著区分 gE 基因缺失疫苗免疫猪血清和野毒感染猪血清 ,而且具有简便、快速等优点。检测临床 36 0份猪血清 ,阳性率为 5 7 78% (2 0 8/ 36 0 ) ,比国外阻断 gE -ELISA的 5 8 0 6 % (2 0 9/ 36 0 )略低 ,阳性符合率为 94 86 % (2 0 3/ 2 14 ) ,总符合率为 96 94 % (349/ 36 0 ) ,两种检测方法结果差异不显著 (P >0 0 5 )。

中国不同丁型肝炎病毒株抗原编码区基因的cDNA特点分析

为研究我国不同地区不同人群中丁型肝炎（丁肝）病毒（ＨＤＶ）毒株感染的分子特征，从我国河南、内蒙、北京、四川、广西、西藏、新疆、辽宁、上海等地的ＨＤＶ健康携带者、慢性丁肝病人与重症肝炎病人中，筛选获得１０余份ＨＤＶ－ＲＮＡ阳性血清，经逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）交叉扩增获得ＨＤＶ抗原编码区的ｃＤＮＡ片段，并克隆到ｐＧＥＭ－３ｚｆ（－）或ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，经序列分析研究其基因结构特点，结果表明：中国的ＨＤＶ毒株其基因型均为Ⅰ型，其中河南－１、－２、－３株及新疆株为ⅠＡ亚型；内蒙－１、四川、广西、西藏－１、辽宁、北京株为ⅠＢ亚型。与中国台湾株相比，４株ⅠＡ亚型的大陆ＨＤＶ抗原编码区核苷酸与氨基酸序列在多个位点的变异是保守而特异的，主要集中于Ｎ端；与美国－１株相比，中国大陆ⅠＢ亚型株变异较少，分布散在。中国大陆株ⅠＡ与ⅠＢ株各自存在多个特征性的核苷酸保守位点，可作为中国大陆ＨＤＶ的进化标志及ⅠＡ、ⅠＢ亚型株的区分指标。

猪瘟野毒不同代次E2基因主要抗原编码区序列差异分析

利用 RT-PCR及序列测定对 5株猪瘟野毒 1 4个不同代次毒株 E2基因主要抗原编码区序列进行了分析。结果表明每个野毒的不同代次毒株核苷酸及氨基酸序列均呈现较高的保守性 ,核苷酸及氨基酸序列均无变化 ,核苷酸及氨基酸同源性均为 1 0 0 %。与 0 2号野毒相比 ,其他 4株野毒核苷酸及氨基酸同源性分别为 82 .0 %～ 99.5%、84.1 %～ 98.6 %。遗传衍化分析结果表明所有毒株被分成 2个基因组 ,每个基因组又分成 2个基因亚组。 0 3、0 5和 2 2号毒株位于第一基因组 ,0 2、0 6号毒株位于第二基因组。每一个毒株的不同代次毒株均位于同一基因组、同一基因亚组。

中国不同地区和人群HDV cDNA的筛选、克隆及抗原编码区基因异质性的分析

为研究我国不同地区不同人群中ＨＤＶ毒株的感染分子特征，从我国河南、内蒙、北京、四川、广西、西藏、新疆、辽宁、上海等地的ＨＤＶ健康携带者、慢性丁肝病人与重症肝炎病人中筛选获得１０余份ＨＤＶ－ＲＮＡ阳性血清。经逆转录一多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）交叉扩增获得ＨＤＶ抗原编码区的ｃＤＮＡ片段并克隆到ＰＧＥＭ－３Ｚｆ（－）或ＰＧＥＭ－Ｔ载体上，经序列分析研究其基因结构特点，结果表明：中国的ＨＤＶ毒株基因型均为Ⅰ型，但至少存在ⅠＡ、ⅠＢ两个亚型，ＨＤＶ毒株在不同地区间存在异质性，其中河南－１、－２、－３株及新疆株与台湾株同源性较高（核苷酸与氨基酸同源性分别大于９２．１％与８６．９％）．当为ⅠＡ型；内蒙－１、四川、广西、西藏－１、辽宁、北京株与美国－１株同源性较高（核苷酸与氨酸同源性分别大于９４．３％与８８．８％），当为ⅠＢ亚型；上海株与意大利株的核昔酸同源性最高，为９８．１％。研究证明我国新疆、内蒙、西藏等地区抗ＨＤ阳性率比其他省市高并不是由于存在其他基因型所致。

猪伪狂犬病毒Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区的克隆及序列分析

为了研究猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因主要抗原表位区是否可以进行原核表达,试验根据GenBank中发表的PRV GDSH株(EF552427)和Guizhou-DY株(JX417716)的基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR扩增Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区,并进行克隆与序列分析。结果表明:Guizhou-DY株gE基因主要抗原表位区全长为636 bp,与韩国Yangsan株和国内GDSH株核苷酸同源性较高,分别为99.4%和99.2%;与韩国Yangsan株和国内GDSH株、HNJZ株氨基酸同源性较高,均为98.6%。说明该分离株与韩国Yangsan株和国内GDSH株具有较近的亲缘关系。

汉滩病毒S片段基因编码区在Vero-E_6细胞中的表达

汉滩病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，主要引起人类肾综合征出血热［１］。我国是肾综合征出血热发生和流行的主要疫区，该病起病急、病死率高，流行范围广，因此寻找安全有效、低廉的疫苗是控制本病流行和发生的关键。基因免疫是近年来微生物学和免疫学研究的新热点［２...

人巨细胞病毒B基因抗原编码区表达产物的初步应用

目的 人巨细胞病毒(HCMV)52kd糖蛋白重组表达质粒(pHCMV52)经诱导、增殖、提取并纯化表达产物。方法 采用同位素法(125IproteinA)和非同位素法(碱性磷酸酶标记抗人IgG)检测了已知ELISAHCMV-IgM阳性和阴性血清各77例和4例。结果 同位素法与ELISA一致,非同位素法阳性例为75/77例。表达产物免疫家兔制备的抗血清,用ABC法检测肝组织中HCMV抗原,发现HCMV52kd糖蛋白抗原主要位于感染细胞核内和细胞表面。结论 HCMV基因工程抗原及其抗体,可检测HCMV早期抗原和抗体,对HCMV感染的临床诊断,鉴别诊断及判断预后有重要意义。

猪瘟病毒E2基因主要抗原区原核表达载体的构建及表达

用RT PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株 (Shimen)、近期地方流行的属于第 1群毒株的新疆毒株 (XJ)和第 2群代表毒株甘肃临洮 (LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增 ,均得到约 5 6 1bp的基因片段 ;经克隆测序及序列分析 ,该基因编码 187个氨基酸残基 ,预计蛋白分子质量为 2 1.7ku。将这 4个基因分别克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1中 ,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中 ,阅读框是正确的 ,从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL2 1(DE3)中 ,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG )进行诱导表达 ,对表达的蛋白用SDS PAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明 ,E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达 ,表达的蛋白多以包涵体形式存在 ,表达产物的分子质量约为 5 0 .0ku ,与理论推测的分子质量一致 ;薄层凝胶扫描分析表明 ,表达蛋白约占菌体蛋白总量的 2 0 .1% ;免疫印迹结果证明 ,表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。

易变山羊草两个y-型高分子量谷蛋白新亚基的鉴定及基因编码区分子克隆

利用 SDS-PAGE和分子克隆方法研究了易变山羊草的高分子量谷蛋白亚基及其基因。结果表明 ,四倍体易变山羊草有 3个可表达的高分子量谷蛋白亚基。其中一个亚基的迁移率很慢 ,推测其为 Glu-U1 x;另外2个亚基的迁移率分别与中国春的 Bx7和 By8接近或更慢 ,利用一对特异扩增基因编码区的引物得到的扩增片段长度分别为 2 .5 kb和 1 .9kb。分子克隆得到阳性质粒 p2 .5和 p1 .9。基因测序结果显示二者均为 y型高分子量谷蛋白基因 ,它们与普通小麦中已经报道的 y型高分子量谷蛋白基因在核苷酸和氨基酸序列上都存在差异 ,是

蒿甲醚预防日本血吸虫病诱导的兔特异抗体相关靶抗原编码基因的筛选

目的寻找应用蒿甲醚预防血吸虫后,引起免疫保护作用的抗原分子,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法感染血吸虫7天后的家免口服蒿甲醚,收集血清,用蒿甲醚预防后的免疫免血清筛选日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)成虫 cDNA 文库,并对阳性克隆的插入基因片段进行 PCR 扩增及测序分析。结果经三轮筛选,获8个阳性克隆。测序分折所获的这8个序列,其中5个序列分别与日本血吸虫三磷酸甘油醛脱氢酶基因(Sj GAPDH)基因同源,其余3个序列为日本血吸虫28kD 谷胱甘肽-S-转移酶(Sj.GST)基因。结论 Sj.GAPDH 和 Sj.28kDGST 可能是蒿甲醚杀伤血吸虫后,引起对再感染起免疫保护作用的抗原分子。

口蹄疫病毒O/NY00株基因组L片段的克隆及其基因特征

采用RT—PCR方法对口蹄疫病毒O/NY00株基因组L片段进行了分子克隆和序列测定。结果表明:获得的O/NY00株基因组L片段长7805nt,其中包括715at的5’非编码区和6999nt的多聚蛋白编码区。将O/NY00株与其它参考毒株进行序列比较,结果显示:O/NY00株与O/SKR/2000、O/UKG/3/2001遗传关系最近,而与其它毒株遗传关系较远,属于O型口蹄疫ME-SA拓扑型PanAsia株的成员。与Cathay拓扑型的代表毒株O/TAW/97比较,两者在主要抗原位点1和位点3呈现出明显的以拓扑型为特征的氨基酸差别,提示两拓扑型毒株之间有较高的抗原差异。

江苏地区汉族人群HLA-G 3'非翻译区基因多态性和单体型分析

目的调查江苏地区合格献血者HLA-G 3'非编码区(3'-UTR)基因多态性和单体型特征。方法提取江苏地区合格献血者全血基因组DNA,PCR方法扩增HLA-G 3'UTR,利用基因测序对多态性位点进行基因分型,直接计算基因频率和基因型频率,利用SHEsis软件分析单体型。结果江苏地区88名献血者HLA-G 3'UTR共有8个多态性位点:+2960 14 bp插入/缺失,+3003C/T,+3010C/G,+3027A/C,+3035C/T,+3142C/G,+3187A/G,+3196C/G,其基因频率及基因型频率均符合Hardy-weinberg平衡定律(P>0.05);各位点紧密连锁(D'>0.7),SHEsis软件分析求得频率>0.03的单体型有6种,其中单体型UTR-3(DTCCCG AC,频率=0.256)最为常见。结论本研究分析了江苏地区合格献血者HLA-G 3'UTR的8个多态性位点、连锁不平衡和单体型频率的特征,对于研究本地区HLA-G的基因多态性以及与相关疾病的关系提供了重要依据。