鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。

PRV FB株gE/gI基因缺失株的构建及其灭活疫苗免疫保护效力评价

自2011年以来,新型伪狂犬病病毒(PRV)变异株在我国免疫猪场不断出现,导致目前商品化疫苗免疫效果不佳。为研究PRV FB株gE/gI基因缺失株疫苗防控新型PRV变异株感染的效果,本研究以PRV自然弱毒FB株作为亲本株,通过同源重组的方法构建了PRV g E/gI基因缺失株,将不同代次PRV FBΔgE/gI株与亲本PRV FB株分别接种BHK-21细胞,观察CPE和测定TCID50效价,分析缺失株的遗传稳定性,结果显示FBΔgE/gI株感染BHK-21细胞后产生与亲本株FB相似的CPE,且不同代FBΔgE/gI株的TCID50与亲本株相比均无明显变化。将FB株、FBΔgE/gI株、Bartha-K61株分别接种健康新西兰兔,比较三者的安全性,结果显示,接种BarthaK61株的家兔全部死亡(5/5),接种FB株的家兔死亡2只(2/5),而接种FBΔgE/gI株的家兔全部(5/5)健活,表明FBΔgE/gI株对新西兰兔的致病力较低,安全性更高。将FBΔgE/gI株分别与水相佐剂GEL02和两性佐剂ISA 206制成灭活疫苗免疫绵羊28 d后,采用ELISA法检测各组绵羊的gB和gE抗体,并且以PRV变异株FJ-2012攻毒,评估FBΔgE/gI株灭活疫苗对绵羊的保护效力,结果显示,接种GEL02和ISA 206为佐剂的FBΔgE/gI灭活疫苗绵羊在免疫后28 d,抗体均全部转阳;对照组绵羊在攻毒后6 d内全部死亡(5/5),以GEL02作为佐剂的灭活疫苗组绵羊死亡2只(2/5),而以ISA 206为佐剂的绵羊全部存活(5/5),保护率达到100%,表明以ISA 206作为佐剂的FBΔgE/gI株灭活疫苗能够完全保护绵羊抵御PRV变异株的攻击。本研究首次基于PRV自然弱毒FB株构建的FBΔgE/gI株,与Bartha-K61株相比具有更高的安全性,与佐剂ISA 206制成灭活疫苗免疫绵羊后能够完全抵抗新发变异PRV的攻击,具有完全保护作用。本研究为我国新发变异PRV疫苗的研发提供了新的参考依据。

伪狂犬病病毒上海株gE^-/gI^-/GFP^+缺失株的生物学特性初步研究

在构建了伪狂犬病病毒上海株的缺失载体 pgEI-GFP 基础上,将 pgEI-GFP 转染感染了 PRV-SH 株的 BHK-21细胞,待出现 80%以上的细胞病变时收获病毒,并以绿色荧光蛋白为标志,通过蚀斑法得到纯化重组病毒gE-/gI-/GFP+ 缺失株。研究了该缺失株的的安全性、在细胞上的生长特性以及对断奶仔猪的安全性、免疫原性等生物学特性。试验结果显示,缺失了 gE-和 gI-后,不影响其在 RK 细胞上的生长状况和病毒的滴度。该疫苗株对小鼠的半数致死量比亲本毒低且对家兔的致死性的时间延长了,这表明该疫苗的毒力比亲本毒有所下降。该缺失株对断奶仔猪安全,无不良接种反应,接种断奶仔猪能抵御高剂量 PRV-SH 株强毒的感染,攻毒后试验猪的发热期、散毒天数均低于对照组。该缺失株接种仔猪后在试验期间一直维持较高水平的中和抗体。

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE^-/gI^--EGFP^+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE^-/gI^-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。

新发变异伪狂犬病毒FJ2012株灭活疫苗制备和免疫效力评价

【目的】比较不同种类佐剂制备的伪狂犬病毒(PRV)FJ2012株灭活疫苗的免疫效力。【方法】对PRV新发变异毒株FJ-2012的gE/gI基因采用同源重组技术缺失构建gE/gI基因缺失株(FJ-2012ΔgE/gI株),经甲醛灭活后分别与水相佐剂GEL02、两性佐剂ISA 206VG和白油佐剂制成不同种类的灭活疫苗,经质量检查后免疫绵羊,免疫28 d后采用ELISA法检测各组绵羊的gB和gE抗体,并且以变异毒FJ-2012攻毒,评估不同灭活疫苗对绵羊的保护效力。【结果】成功构建了基因缺失株FJ-2012ΔgE/gI,并制备3种不同佐剂的灭活疫苗,接种绵羊后均无不良反应发生。免疫28 d后gB抗体均全部转阳,gE抗体阴性;对照组绵羊在攻毒后6 d内全部死亡(5/5),以GEL02和白油作为佐剂的灭活疫苗组绵羊全部存活(5/5),保护率达到100%,而以ISA 206VG作为佐剂的免疫组绵羊死亡2头,保护率仅为60%(3/5)。【结论】以GEL02佐剂和白油佐剂制成的FJ-2012ΔgE/gI株灭活疫苗免疫绵羊后可以抵御变异毒亲本株FJ-2012株的攻击,能够对我国目前新发变异PRV的防控提供技术保障。

猪伪狂犬病蜂胶疫苗和油佐剂疫苗对小白鼠注射部位损伤的病理组织学比较

用猪伪狂犬病 g E/ g I基因缺失蜂胶灭活疫苗和油佐剂疫苗分别腿肌注射免疫实验动物小白鼠 ,分别于免疫后 2 ,7,1 4 d和 3 5d剖杀 ,取注射部位的肌肉组织 ,常规石蜡包埋切片观察。结果表明 ,蜂胶苗注射后立即吸收 ,局部不留痕迹 ,感官与对照相比无任何差异。免疫 2 d注射局部显微变化轻微 ,7d后肌纤维间隙发现吞噬黄色蜂胶疫苗的细胞 ,1 4 d此种细胞更多 ,3 5d汇聚成片 ;油苗注射后在 3 5d的试验期内一直未能全部吸收。免疫 2 d见肌纤维断裂、肿胀、坏死 ,大量嗜中性粒细胞浸润 ,肌纤维间隙广泛分布油囊 ,7d时局部炎症仍很严重 ,1 4 d表现炎症转归 ,至 3 5d形成肉芽组织包裹的油囊结构。结果表明 ,蜂胶疫苗免疫后 ,不但局部组织学影响明显小于油苗注射组 ,而且可趋化大量吞噬细胞到注射局部 ,促进抗原高效递呈 ,且可在注射局部的吞噬细胞胞浆中停留 3 5d以上 ,可能起到了类似“抗原库”的作用 。