针刺对炎症痛大鼠痛阈及下丘脑Gi蛋白表达的影响

目的:观察电针(EA)治疗对佐剂性关节炎(AA)大鼠腰椎夹脊穴的镇痛效果,及下丘脑抑制性G蛋白(Gi)含量的变化,以初步探讨针刺镇痛的细胞信号转导机制。方法:24只大鼠随机分为正常组、模型组和电针组,分别给予干预措施。用行为学痛阈法观察大鼠痛阈的变化;运用免疫印迹法(Westernblot)检测下丘脑Gi蛋白的变化。结果:EA夹脊穴提高了炎症痛大鼠的痛阈,降低了下丘脑Gi蛋白的表达。结论:炎症痛的产生发展可能与大鼠下丘脑G蛋白信号传导系统功能障碍有关,针刺镇痛介导的G蛋白信号通路可能是治疗炎症痛关节炎的重要机制之一。

Gi蛋白βγ亚单位在氨甲酰胆碱所致CCL137细胞磷脂酰A_2激活中的作用

为研究氨甲酰胆碱（ＣＣｈ）所致ＣＣＬ１３７细胞中毒蕈碱型乙酰胆碱受体（ｍＡＣｈＲ）失敏时磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）激活的机理，应用百日咳杆菌毒素（ＰＴＸ），抗－βγ血清和纯化的Ｇｉβγ，分别观察了它们对ＰＬＡ２活性的影响．当在培养液中加入ＰＴＸ或抗－βγ血清时，可见ＣＣｈ不再能引起ＣＣＬ１３７细胞中ｍＡＣｈＲ失敏和ＰＬＡ２激活．反之，加入Ｇｉβγ或ＧＴＰ－γ－Ｓ则使ＰＬＡ２激活，且呈剂量依赖关系，前者尤为明显．结果表明，Ｇｉβγ在ＣＣｈ所致ＣＣＬ１３７细胞的ＰＬＡ２激活中起重要作用．

牛传染性鼻气管炎病毒gI蛋白截短表达与单克隆抗体制备

为获得牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gI蛋白单克隆抗体,构建了gI截短基因重组原核表达质粒pET-32a-gI,并对其进行了诱导表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blot验证了gI蛋白在大肠杆菌内的表达情况。将纯化的gI蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,得到针对IBRV gI蛋白的单克隆细胞株gI14。利用体内诱生法制备抗IBRV gI蛋白单克隆抗体腹水,使用Western blot和间接免疫荧光(IFA)对单克隆抗体特异性进行检测和验证。Western blot结果显示:原核表达的gI融合蛋白相对分子质量为34 ku,gI蛋白单克隆抗体与gI表达蛋白反应性良好,与pET-32a(+)空载体蛋白无特异性结合;天然表达的gI蛋白相对分子质量为45 ku,gI蛋白单克隆抗体与细胞内感染的IBRV所表达的gI蛋白反应性良好。IFA结果显示,gI蛋白单克隆抗体及阳性对照组IBRV多抗均能与细胞内感染的IBRV发生特异性结合,使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。结果表明,本研究基于高效表达的gI蛋白,成功制备了1株能稳定表达gI单克隆抗体的细胞株gI14,获得的gI蛋白单克隆抗体与原核表达的gI蛋白及IBRV全病毒均能特异性结合,这为进一步研制IBRV诊断试剂盒及探究IBRV gI蛋白抗原表位及蛋白功能奠定了基础。

甲状腺功能减退大鼠海马Gs、Gi蛋白α亚基蛋白表达及半硫丸对其的调节作用

目的:观察甲状腺功能减退大鼠海马组织Gs、Giα亚基蛋白表达的变化及半硫丸对其的影响,探讨半硫丸防治甲减性脑损伤的作用机制。方法:将实验大鼠随机分为正常对照组和造模组,造模大鼠于每日腹腔注射PTU诱发甲状腺功能减退动物模型后,将造模大鼠进一步随机分为模型组、甲状腺片组、半硫丸组,治疗组分别予相应药物治疗。采用Westernblotting检测技术对每组大鼠脑海马组织Gs、Giα亚基蛋白表达水平进行分析。结果:甲减大鼠海马组织Gsα蛋白的表达水平与正常组比较无显著性差异(P>0·05)。甲减大鼠海马Giα蛋白的表达较正常组显著升高(P<0·01),半硫丸可显著下调甲减大鼠海马Giα蛋白的表达(P<0·01)。结论:甲减大鼠脑海马组织抑制性G蛋白Giα的蛋白表达明显升高,而刺激性G蛋白Gsα的蛋白表达水平无显著性变化,说明甲减脑组织Gsα的含量变化与脑损害的关系不大。半硫丸可以下调甲减大鼠脑组织Giα蛋白的表达水平,通过解除对生长锥的过度抑制,以利于神经突起和突触的改建和塑形,进而促进甲减脑神经元功能的恢复。

Gi蛋白真核表达载体的构建及表达检测

目的:克隆抑制腺苷酸环化酶G蛋白(Gi蛋白)3个亚基α、β和γ基因,构建p EYFP-N-Giα1和p ECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,完成其在真核细胞中的表达检测。方法:培养肝癌细胞Hep G2,提取总RNA后反转录成c DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增α、β和γ的编码基因,在α亚基两端添加酶切位点,在β和γ亚基两端分别添加酶切位点和连接肽,经酶切和连接得到Giα1和Giβ1-γ2,再将Giα1和Giβ1-γ2基因分别构建到荧光蛋白报告载体p EYFP-N1和p ECFP-C1中,利用脂质体法将真核表达载体转染到肝癌细胞中,激光共聚焦显微镜观察分析其表达活性。结果:PCR扩增获得Gi蛋白α、β和γ亚基的编码基因,在两端添加酶切位点和连接肽后获得的Giα1和Giβ1-γ2基因,成功构建了p EYFP-N-Giα1和p ECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,并在肝癌细胞中实现其真核细胞表达。结论:成功构建Gi蛋白的真核表达载体,并鉴定其在活细胞中具有表达活性。

β1整合素及细胞骨架结构对Gi蛋白心肌细胞内构型的影响

采用免疫荧光双标记、免疫电镜等方法观察胚胎干细胞系及小鼠胚胎心肌细胞中多种G蛋白细胞内构型特点及其与细胞骨架锚蛋白之间的相关性。结果发现Gi在野生型胚胎干细胞和小鼠胚胎心肌细胞内呈网状分布 ,且与细胞骨架蛋白分布一致。而在 β1整合素基因敲除胚胎干细胞中Gi则呈近似于弥漫样分布 ,与细胞骨架蛋白的分布无相关性。在G2 0 1N细胞 ,Gi又恢复其特有的网样分布。细胞骨架解聚剂可模拟 β1整合素基因敲除所造成的Gi构型改变。提示

Gi蛋白介导生长抑素5激活对垂体催乳素腺瘤激素分泌的抑制作用

目的:通过体外实验探讨生长抑素5(SSTR5)激活对垂体催乳素腺瘤激素分泌的抑制作用及其机制。方法:使用前期研究中构建好的SSTR5过表达的GH3细胞系作为垂体催乳素腺瘤的体外细胞模型,使用SSTR5激动剂BIM23052联合其他G蛋白下游通路的抑制剂进行细胞刺激,荧光素酶报告基因检测Prl-luc启动子活性,酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒检测细胞上清催乳素(PRL)的浓度。Student’s t检验和单向方差分析进行组间统计分析。结果:预处理Gi蛋白抑制剂百日咳毒素后GH3 SSTR5细胞中Prl启动子活性从对照组[Ctrl(Control)组(100.00±6.82)%比BIM组(BIM23052)组(69.08±7.09)%,t=5.43,P<0.01]到干预组[Ctrl组(107.86±12.40)%比BIM组(115.51±11.76)%,t=0.76,P>0.05],预处理百日咳毒素后细胞上清PRL的浓度变化从对照组[Ctrl组(100.00±12.38)%比BIM组(70.60±9.12)%,t=3.31,P<0.05]到干预组[Ctrl组(91.31±9.81)%比BIM组(89.91±9.48)%,t=0.18,P>0.05],百日咳毒素可消除BIM23052对Prl启动子活性的影响;beta-ARK过表达激活G beta-gamma亚单位,Prl启动子活性从空白转染组[Ctrl组(100.00±3.27)%比BIM组(64.70±2.26)%,t=15.38,P<0.01]到betaARK过表达组[Ctrl组(96.91±5.36)%比BIM组(70.12±6.82)%,t=5.35,P<0.05],beta-ARK过表达并不影响BIM23052对Prl启动子活性的抑制作用。使用cGMP类似物Rp8-pCPT-cGMPS、PKG抑制剂KT5823和PKG inhibitor、PKC广谱抑制剂Staurosporin和G?6983预处理GH3 SSTR5细胞,均不影响BIM23052对Prl启动子活性的抑制作用,其中cGMP类似物Rp8-pCPT-cGMPS为,Prl启动子活性从对照组[Ctrl组(100.00±3.97)%比BIM组(52.98±5.16)%,t=12.5,P<0.01]到干预组[Ctrl组(95.99±5.38)%比BIM组(60.23±2.63)%,t=10.35,P<0.01];PKG抑制剂KT5823为,Prl启动子活性分别从对照组[Ctrl组(100.00±2.50)%比BIM组(72.64±0.45)%,t=18.66,P<0.01]到干预组[Ctrl组(93.13±9.31)%比BIM组(53.54±11.50)%,t=4.30,P<0.05];PKG inhibitor为,对照组[Ctrl组(100.00±7.55)%比BIM组(64.07±3.49)%,t=7.48,P<0.01]到干预组[Ctrl组(96.27±4.89)%比BIM组(74.17±1.16)%,t=7.62,P<0.01];Staurosporin为,不同浓度梯度0、5、50、100 nmol/L,Prl启动子活性分别从Ctrl组[(100.00±5.07)%、(102.03±1.08)%、(131.85±4.33)%、(109.62±7.98)%]到BIM组[(68.35±4.63)%、(74.24±9.64)%、(90.18±8.87)%、(85.24±6.63)%,P<0.01];G?6983为,Prl启动子活性分别从对照组[Ctrl组(100.00±7.81)%比BIM组(66.09±7.66)%,t=4.79,P<0.05]到干预组[Ctrl组(92.37±5.78)%比BIM组(77.31±1.54)%,t=3.43,P<0.05],提示PKG和PKC抑制剂均不影响BIM23052对Prl启动子活性的抑制作用。结论:SSTR5激活对PRL合成的抑制作用是通过Gi alpha介导的,而不是通过涉及PKG或PKC的替代途径。

新型Gi蛋白偏向性阿片受体(MOR)激动剂LPM3480392原料药有关物质测定

目的建立新型Gi蛋白偏向性阿片受体(MOR)激动剂LPM3480392的有关物质测定方法。方法采用Waters Symmetry Shield RP18(150 mm×4.6 mm,3.5μm)色谱柱,以0.0025 mol·L^(-1)辛烷磺酸钠的0.01 mol·L^(-1)磷酸二氢钾水溶液(含0.1%的三乙胺,磷酸调节pH 2.50)和乙腈为流动相,梯度洗脱,流速1.0 mL·min^(-1),紫外检测波长210 nm。结果LPM-3480392与杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质F的色谱峰能够完全分离。LPM3480392质量浓度在0.0649~5.1912μg·mL^(-1)内线性关系良好;杂质A、B、C、E、F质量浓度分别在0.0666~7.6104μg·mL^(-1),0.1660~3.7940μg·mL^(-1),0.2092~4.4632μg·mL^(-1),0.1679~7.6726μg·mL^(-1),0.0164~7.5057μg·mL^(-1)线性关系良好;回收率在93.0%~103.2%。结论该方法可准确测定LPM3480392的有关物质,可为LPM3480392的后续研究与开发提供有价值的参考。

α疱疹病毒gE和gI蛋白的多样化功能

疱疹病毒为双股线性DNA病毒,是引起人与动物疾病的一类重要病原,成熟的病毒粒子由核心、衣壳、间层及囊膜组成。近年来,对以单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)及伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)等为代表的α疱疹病毒在病毒复制和增殖、毒力、神经系统侵染机制以及对机体免疫应答影响等方面的研究取得了显著进展,在病毒基因组编码的多种蛋白中,gE和gI蛋白在上述各方面均发挥关键作用。本文就gE和gI蛋白在α疱疹病毒中的多样化功能的最新研究成果进行了总结,并指出其未来研究趋势。

Gi蛋白介导MrgC受体对CFA炎症痛的抗痛觉过敏作用

通过观察完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)炎症痛大鼠对伤害性热刺激的缩足反射潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)变化,探讨Gi蛋白是否介导MrgC受体(Mas-related gene C receptors,MrgC)对炎症痛的抗痛觉过敏作用.结果显示,椎管内给予MrgC受体激动剂BAM8-22(bovine adrenal medulla 8-22,BAM8-22)能明显延长CFA炎症鼠在24 h和48 h时的缩足反射潜伏期基础值,并显著增强24h时的抗伤害作用.椎管内预先给予百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)能抑制Gi蛋白的功能.在给予PTX7 d后,初次给予BAM8-22并不能延长CFA炎症鼠24 h时的缩足潜伏期基础值,但在24 h时再次注射BAM8-22时,能显著增强其抗伤害作用和48 h时的缩足潜伏期基础值.以上结果说明在CFA炎症痛模型中,预先给予PTX能抑制BAM8-22的抗痛觉过敏作用,但重复再次给予BAM8-22能恢复Gi蛋白的功能.表明Gi蛋白及其相关信号通路介导MrgC受体在炎症痛中的抗痛觉过敏作用.

Gi蛋白在心脏β肾上腺素受体信号转导通路中的作用

在生命过程中，生物细胞几乎每时每刻都靠介体传递化学信使以适应环境的变化，其中G蛋白耦联受体（G protein coupled receptor, GPCR）是连接细胞内外信息的重要桥梁之一，国内外众多科学家对其进行了广泛的研究。美国科学家Alfred和Martin因率先分离并确定G蛋白及其在细胞信号转导中的作用而获得1994年诺贝尔生理学和医学奖。2012年，美国科学家Robert和Brian再次因GPCR研究而获得诺贝尔化学奖。

α疱疹病毒囊膜糖蛋白gI影响病毒毒力的分子机制

α疱疹病毒囊膜糖蛋白gI由非必需基因US7编码,在病毒的致病机制中扮演着重要角色。目前研究表明囊膜糖蛋白gI可分别通过参与二次囊膜包被、促进胞间传播在α疱疹病毒粒子组装和扩散过程中发挥重要作用;该蛋白还可以从促进病毒在神经元的轴突转运以及抵抗机体免疫应答等方面影响病毒的毒力。本文对囊膜糖蛋白gI影响α疱疹病毒毒力的分子机制进行总结,为深入研究此蛋白的功能、阐述疱疹病毒的致病机理及疾病防控提供参考。

酸枣仁提取物通过调节Gi/o蛋白表达抑制cAMP-PKA通路促进小鼠骨骼增长的研究

目的:研究酸枣仁提取物通过调节Gi/o蛋白表达抑制cAMP-PKA通路促进小鼠骨骼增长的作用及作用机制。方法:将小鼠分为空白对照组、用药组(酸枣仁提取物组)、阳性对照组(酸枣仁皂苷A组)、Gi/o蛋白选择性抑制剂组,通过观察小鼠用药后体长,血清生长激素含量,脑组织中Gi/o蛋白含量及AC活性,cAMP、PKA含量,确定cAMP-PKA在酸枣仁提取物促进骨骼增长中的作用。结果:药物在引起Gi/o蛋白高表达的同时抑制了cAMP-PKA通路上AC的活性,cAMP、PKA的含量。结论:酸枣仁提取物促进骨骼增高的作用是通过调控Gi/o蛋白表达从而抑制cAMP-PKA通路实现的。

针刺对快速性心律失常大鼠心肌Gi Gs含量的影响

目的:本实验制作大鼠快速性心律失常模型,以针刺大鼠"内关"穴为施加因素,激动性G蛋白(Gs)和抑制性G蛋白(Gi)含量和心电图为实验指标,说明"内关"穴调节快速性心律失常的作用机理。方法:电针刺激乌头碱所致的快速性心律失常模型大鼠双侧"内关"穴,观察针刺前后心律(率)及大鼠心肌细胞Gs、Gi的含量变化。结果:针刺治疗组与模型组相比相关检测指标有明显变化。结论:快速性心律失常和心肌中Gi、Gs有关;G蛋白在针刺内关穴对心律失常的调节中有重要作用。

严重烫伤大鼠心肌抑制性G蛋白α亚基的变化

目的 :研究烧伤早期心肌抑制性 G蛋白 α亚基 (Giα)含量的变化 ,探讨其在烧伤后心肌舒缩功能下降中的作用。方法 :采用 30 %体表面积 度烫伤大鼠模型 ,测定伤前及伤后左心室收缩压 (L VSP) ,左心室压力最大上升与下降速率 (L V± dp/dtm ax)。采用 Western杂交法和放射免疫法分别测定大鼠心肌 Giα及腺苷酸环化酶 (AC)的活性。结果 :与对照组比较 ,烫伤后心功能指标显著降低 ,烫伤后 12、2 4和 48小时心肌 Giα分别升高6 9.5 % (t=5 .79,P<0 .0 1)、37.8% (t=3.89,P<0 .0 1)和 2 9.1% (t=3.42 ,P<0 .0 5 ) ,AC活性降低。结论 :烫伤后 Giα含量升高是导致腺苷酸环化酶信号转导系统功能障碍及心肌舒缩功能下降的重要原因之一。

电针对高血压性脑出血大鼠海马Gi_2α、Gi_3α基因转录的影响

目的:从基因转录水平研究电针对高血压性脑出血的治疗作用及其可能作用机制。方法:双肾双夹法复制易卒中型肾血管性高血压模型,以胶原酶加肝素脑内注射诱发脑出血,建立高血压性脑出血大鼠模型。运用Northernblotting分子杂交技术动态检测电针治疗后不同时相点脑出血大鼠海马Gi蛋白α亚基基因转录水平。结果:模型组大鼠海马Gi2αmRNA、Gi3αmRNA表达明显减弱,其中以Gi2αmRNA表达下降更为明显。电针治疗后,大鼠海马Gi2αmRNA、Gi3αmRNA表达均呈现不同程度的增强,并随着时间的推移而逐渐趋于恢复。结论:电针水沟、内关、足三里穴治疗脑出血的作用机制可能与上调脑组织Giα基因转录水平,使Giα蛋白合成增加,进而减轻了紊乱的信号转导系统对脑组织引起的损害等作用有关。

早搏灵对乌头碱诱导的快速性心律失常大鼠心肌G蛋白含量的影响

目的通过观察早搏灵对乌头碱诱导快速性心律失常大鼠模型心肌Gi蛋白和Gs蛋白含量的影响及心电图变化,探讨其对快速性心律失常的治疗机制。方法将40只健康Wistar大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、胺碘酮组和早搏灵组4组,各10只。采用经尾静脉注射乌头碱方式,将模型组、胺碘酮组、早搏灵组大鼠成功复制快速性心律失常模型。模型组、空白组予0.9%氯化钠注射液10mL/kg灌服;早搏灵组予34.6mg/mL的早搏灵溶液10mL/kg灌服;胺碘酮组予5.5mg/mL的胺碘酮溶液10mL/kg灌服,连续1周。观察并记录每组大鼠心律失常持续时间,并用免疫蛋白印迹法检测心肌Gi蛋白和Gs蛋白灰度值的变化。结果与模型组比较,早搏灵组、胺碘酮组快速性心律失常持续时间缩短(P<0.05),早搏灵组与胺碘酮组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较,模型组、早搏灵组、胺碘酮组Gi蛋白灰度值降低(P<0.05),Gs蛋白灰度值升高(P<0.05)。早搏灵组、胺碘酮组Gi蛋白灰度值高于模型组(P<0.05),Gs蛋白灰度值低于模型组(P<0.05),早搏灵组与胺碘酮组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论早搏灵能有效缩短乌头碱诱导的大鼠快速性心律失常持续时间,升高Gi含量,并且降低Gs含量。

表达马立克氏病病毒gI基因重组鸡痘病毒的免疫原性

以鸡痘病毒为载体,构建含马立克氏病病毒(MDV)gI基因的重组鸡痘病毒(rFPV),并在鸡胚成纤维细胞(CEF)中表达gI基因,用重组FPV(命名为rFPV MDV648gI)感染CEF,结果显示:rFPV MDV648gI能在CEF中稳定复制。进一步用rFPV MDV648gI接种无特定病原(SPF)鸡皮下组织,结果表明:鸡对rFPV MDV648gI具有抗体反应性。

慢性吗啡依赖大鼠脑内G_(i2)蛋白的改变

目的研究慢性吗啡依赖大鼠腹侧背盖区(Ventraltegmentalarea,VTA)、伏隔核(Nucleusaccumbens,NAc)、前额皮质(Prefrontalcortex,PC)、海马(Hippocampus)及去甲肾上腺能神经中枢蓝斑(Locuscoeruleus,LC)五个脑区Gi2蛋白的改变,探讨慢性吗啡依赖的可能机制。方法18只SD大鼠随机分为三组:慢性吗啡依赖组、戒断组和空白对照组。慢性吗啡依赖组和戒断组腹腔注射吗啡,建立吗啡成瘾模型,戒断组腹腔注射纳络酮(5mg/kg)30min后断头处死各组大鼠,取出脑组织,进行冰冻切片。用免疫组化技术检测NAc、PC、LC、VTA和Hippocampus五个脑区相对Gi2蛋白水平。结果慢性吗啡成瘾组和戒断组与空白对照组相比,NAc区Gi2蛋白水平明显降低(P<0.01),LC区Gi2蛋白水平却明显升高(P<0.01),其它脑区未发现明显变化。结论慢性吗啡成瘾可引起大鼠脑内Gi2蛋白水平发生改变,但各脑区Gi2蛋白水平的改变并不相同。Gi2蛋白水平的改变可能是吗啡耐受和依赖潜在的分子机制。

急性吗啡依赖大鼠脑内G_(i2)蛋白的表达

目的研究急性吗啡成瘾后大鼠腹侧背盖区(Ventral tegmental area,VTA)、伏隔核(Nucleus accumbens,NAc)、前额皮质(Prefrontal cortex,PC)、海马(Hippocampus)及去甲肾上腺能神经中枢蓝斑(Locus coeruleus,LC)五个脑区Gi2蛋白的改变,探讨急性吗啡成瘾的可能机制。方法18只SD大鼠随机分为三组,每组6只,分别是急性吗啡成瘾组、急性吗啡戒断组、空白对照组。吗啡成瘾组和戒断组腹腔注射吗啡,直到吗啡成瘾模型建立。戒断组腹腔注射纳络酮5mg/kg,作用30min后断头处死各组大鼠。取出脑组织,进行冰冻切片。用免疫组化技术检测NAc、PC、LC、VTA和Hippocampus五个脑区相对Gi2蛋白水平。结果急性吗啡成瘾组和急性戒断组与空白对照组相比,NAc区Gi2蛋白水平有明显降低(P<0.01),其它脑区则未发现明显的改变。结论急性吗啡成瘾可引起大鼠脑内Gi2蛋白水平发生改变,NAc区Gi2蛋白水平有明显降低,其它脑区则未发现明显的改变。Gi2蛋白水平的改变可能是吗啡耐受和依赖潜在的分子机制。