伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白gK基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达

根据伪狂犬病病毒 (PRV) Ka株序列 ,合成 1对包含 g K基因完整编码区的引物 ,以 PRV Ea株 Bam H 5′片段为模板 ,扩增出 0 .9kb特异性带。将纯化的扩增产物克隆到 p Bluescript SK+ 中 ,构建了重组质粒 p SKg K,用双脱氧末端终止法进行序列测定 ,并同国外 Ka株进行比较。结果表明 ,Ea株 g K基因全长 939bp,编码 313个氨基酸 ,与 Ka株比较 ,Ea株 g K基因有 2 2处点突变 ,但无插入突变和缺失 ,同源性达 97.78%。将 g K基因克隆到原核表达载体p GEX- 2 T中 ,构建了 g K全基因原核表达载体 p2 Tg K939。再用 Bam H 、Xho 酶切 p2 Tg K939,回收 5 88bp g K小片段 ,克隆到原核表达载体 p GEX- KG中 ,构建了 g K部分基因原核表达载体 p KGgk5 88。经 IPTG诱导 ,g K全基因不表达 ,而 g K部分基因表达约 4 0 0 0 0融合蛋白。用 PRV高免血清经 Western blotting证明 ,g K有免疫原性。提取 g K包涵体并制备高免血清 ,EL ISA检测抗体效价为 1∶ 6 4

伪狂犬病病毒Ea株gK基因的真核表达

以伪狂犬病毒Ea株BamH I 5′片段为模板,PCR扩增出约0.9 kbgK基因完整编码区片段,将该基因克隆到pBluescriptIISK+中,构建重组载体pSKgK。进一步将该片段插入真核表达载体pEGFP-C1的增强绿荧光蛋白EGFP下游,构建真核表达载体pEGFPgK,脂质体法转染BHK-21细胞,G418筛选至正常细胞完全死亡,在倒置荧光显微镜下观察,pEG-FPgK转染的细胞在细胞膜和细胞浆中发出很强的荧光,而正常细胞不发荧光。证明gK基因在BHK-21细胞上获得了表达,表达在细胞膜和细胞浆中。

饲料脂肪对翘嘴红鲌生长、葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性与基因表达的影响

选用360尾翘嘴红鲌(Erythrocutler ilishaeformis Bleeker),体质量约40g。随机分成为2组,分别为高脂组(脂肪质量分数19.93%,碳水化合物质量分数14.45%)、低脂组(脂肪质量分数9.92%,碳水化合物质量分数12.38%),每组设3个重复,饲养8周。分别于摄食后0h、3h、6h、12h、24h测定血液指标、糖代谢酶葡萄糖激酶(Glucokinase,GK,E.C.2.7.1.1)以及葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase,E.C.3.1.3.9)活性及基因表达,并分析高脂肪与低脂肪水平日粮对翘嘴红鲌生长的影响。与低脂水平日粮相比,高脂水平日粮组血液甘油三酯水平和游离脂肪酸水平分别在摄食后3h、12h有增加现象,肝胰脏粗蛋白与脂肪含量有显著增加(P<0.05)。与低脂水平日粮相比,在摄食后3～12h高脂肪水平日粮组糖代谢酶GK的mRNA水平显著增加(P<0.05),但是日粮脂肪水平并不能显著影响GK活性(P>0.05)。在摄食后3～24h高脂肪水平日粮组糖代谢酶G6Pase的mRNA水平得到显著促进,并在摄食后24hG6Pase活性显著增加(P<0.05)。因此,摄食高脂肪水平日粮能增加肝胰脏粗蛋白与脂肪含量,造成翘嘴红鲌高血糖效应,诱导G6Pase酶活性及基因的表达,这可能是影响翘嘴红鲌碳水化合物利用的原因之一。

葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的构建及鉴定

目的 构建葡萄糖激酶 (glucokinase ,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系 ,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础。方法 质粒pCMV4 GKZ1经EcoRⅠ BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN ,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX GK ,采用酶切及测序对重组体进行鉴定。而后脂质体转染PLX GK至包装细胞PA3 17,检测培养上清病毒滴度 ,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定。结果 构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX GK ,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变 ;建立了稳定产毒细胞系PA3 17 GK ,其培养上清平均病毒滴度为 6.8× 10 5cfu ml,最高为 1.8× 10 6 cfu ml ,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA3 17 GK细胞基因组并有GK的表达。

泽泻提取物对自发性糖尿病大鼠Bmal1(Arntl)、Acsl5、Gpx1基因表达的影响

目的:通过观察泽泻提取物对自发性糖尿病(GK)大鼠Bmal1(Arntl)、Acsl5、Gpx1基因表达的影响,以期揭示泽泻降低血糖、血脂可能的基因基础从而为临床应用提供理论依据。方法:GK大鼠随机分为泽泻组(n=9)和空白组(n=9),泽泻组给予提取物0.1 mL(30 mg)每100 g大鼠体重灌胃,1 d2次(约为人用量30 g.d-1),空白组给予等体积生理盐水。给药30 d后,麻醉取肝脏,抽提总RNA,反转录后,定量RT-PCR分析各基因mRNA表达量。结果:泽泻提取物极显著抑制了Bmal1基因的高表达(P<0.001),而对Acsl5、Gpx1的表达无显著影响(P>0.05)。结论:泽泻降低血糖、血脂并用于糖尿病治疗的机制可能与其抑制Bmal1的高表达有关。泽泻对GK大鼠Bmal1、Acsl5、Gpx1基因的调控方式与中医"治未病"以及"治本"的理念相一致。

猪伪狂犬病病毒SL株gK基因的生物信息学分析

对猪伪狂犬病病毒(PRV)四川分离株(SL株)gK基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对gK基因进行了同源性、遗传进化树、密码子偏向性、蛋白质二级结构预测及抗原表位分析。结果显示,成功克隆了PRVSL株gK全基因,其编码区长939bp,编码313个氨基酸残基,与其他PRV分离株核苷酸序列同源性为97.6%～99.9%,与国外分离株的同源性略高于国内分离株。gK基因存在4个跨膜区及1个明显的CpG岛。表明成功克隆了PRVSL株gK基因,该基因具有潜在的抗原性。

广西巴马小型猪GK基因真核表达载体的构建及鉴定

GK基因在糖尿病的发生中具有重要功能,本研究旨在构建广西巴马小型猪GK基因真核表达载体,为生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定一定基础。以广西巴马小型猪肝脏组织为材料,通过RT-PCR的方法扩增并克隆猪GK基因的编码序列,并进行生物信息学分析,并将GK基因亚克隆至p EGFP-N1载体上,构建含有GK基因的真核表达载体p EGFP-N1-GK,经过PCR和双酶切的验证,通过脂质体转染,将重组质粒p EGFP-N1-GK转染猪的PK15细胞,48 h之后通过荧光显微镜观察细胞荧光蛋白的表达。研究结果表明广西巴马小型猪GK基因编码区序列长1 575 bp长的片段,共编码524个氨基酸,与Pubmed中查询到的猪(FJ436399.1)的GK基因同源最高,序列比对发现,在461 bp和534 bp处都发生了C-T的碱基突变,只有461 bp位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,成功构建p EGFP-N1-GK真核表达载体,并在PK15细胞中成功转录表达。为进一步研究葡萄糖激酶基因(GK)与糖尿病之间的关系,以及生产转GK基因的广西巴马小型猪奠定基础。

热带假丝酵母高效利用甘油研究

目的：热带假丝酵母以油脂为底物发酵时会产生副产物甘油,研究对热带假丝酵母gk基因进行过表达,将副产物甘油转化为能量,提高油脂转化利用效率。方法：以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798中的甘油激酶（gk）为研究对象,利用PCR技术获得同源臂基因gkpR,通过一步法无缝克隆将同源臂和G418抗性基因（kanr）连接至pPICzαA载体,同时将解脂假丝酵母Candida lipolytica 1457中的启动子基因pGAP无缝连接至载体中的gkpR,构成质粒pPICzαA-gkp,并电转化至C.tropicalis 1798感受态细胞中,通过一次同源单交换,将启动子pGK替换为pGAP。结果：经过G418抗性筛选和PCR鉴定,成功获得pGAP基因替换菌株C.tropicalis 1798-gkPr;发酵验证结果显示,启动子基因替换C.tropicalis 1798在以甘油为底物培养时重组菌OD600值比野生型菌株高46.4%,重组菌培养基中甘油剩余量比野生菌降低56.1%,表明启动子替换能促进C.tropicalis1798对甘油的吸收利用。此外,以油脂为底物进行发酵实验时还发现重组菌产长链二元酸的量比野生菌提高32.7%。结论：通过启动子替换手段构建的重组菌C.tropicalis 1798-gkPr,提高了热带假丝酵母对油脂组分中甘油成分的利用效率。