伪狂犬病毒SL株gL基因的克隆、原核表达、抗体制备及亚细胞定位

通过PCR从伪狂犬病毒(PRV)SL株基因组中扩增出gL基因,将产物亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,测序验证后将重组质粒转化至E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约33 000,同预期大小相符,通过Western blot检测可知重组蛋白具有较好的抗原性。使用Ni 2+-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白,纯化后的重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,经琼脂扩散试验测定,效价达1∶8。通过免疫荧光技术进行PRV gL亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4h的细胞质中检测到特异性荧光,并随着PRV的复制gL表达增加。试验结果为进一步研究gL基因的功能和PRV的致病机理提供了重要依据。

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了 1对PCR引物 ,以伪狂犬病病毒Ea株 (pseudorabiesvirusEa ,PRVEa)基因组DNA为模板 ,扩增出一大小为 5 11bp的片段。通过酶切和测序证实 ,该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因 ,即gL基因。Blast软件分析表明 ,该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为 94% ,氨基酸序列的同源性为 95 %。将测序结果输入GenBank ,获得登录号AF44 845 6。

GLS1基因在乳腺癌中的表达及在新辅助化疗中的意义

目的 探讨GLS1基因在乳腺癌中的表达及在新辅助化疗中的意义。方法 收集134例乳腺癌患者为研究对象,入组患者经过穿刺活检确诊乳腺癌后,按照随机对照原则平均分成两组,每组67例。观察组在乳腺癌改良根治术前使用多西他赛＋表柔比星＋环磷酰胺（TEC）方案,进行3~4周期的化疗后再进行择期手术。对照组在改良根治术前不进行TEC化疗,直接手术摘除病变乳腺。术后两组患者采用免疫组化法,对病变组织中GLS1蛋白免疫组化染色。结果 GLS1基因在134例患者正常组织和乳腺癌组织中表达,但在乳癌组织中表达明显升高,差异有统计学意义（P〈0.05）;术前采用新辅助化疗后,癌组织中GLS1基因表达水平明显低于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。患者生存率与GLS1表达水平有关（P〈0.05）,表达水平越高生存率越低。结论GLS1基因在乳腺癌患者癌组织中高表达。在乳腺癌改良根治术前,使用辅助化疗可明显降低GLS1的表达水平;患者癌组织中GLS1基因表达水平与生存预后相关,GLS1基因在乳腺癌靶向治疗以及靶向治疗药物开发中可作为特异性的药物靶点之一。

SH3GL2基因对喉癌细胞增殖、凋亡的影响及在化疗增敏中的作用

目的探讨SH3GL2基因对喉癌细胞凋亡、侵袭能力的影响,及其对化疗药物顺铂(DDP)敏感性的影响。方法构建重组载体pcDNA3.1-SH3GL2,转染Hep2细胞;RT-PCR、Westernblot检测转染后SH3GL2基因的表达改变;MTT法测定细胞毒性指数,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;应用DDP后检测细胞的凋亡和增殖情况。结果成功构建重组载体;转染Hep2细胞后SH3GL2基因的表达与对照组比较有明显增强,凋亡明显升高(P<0.05),增殖能力明显下降(P<0.05);与DDP处理组比较,联合处理组细胞的凋亡增加更为明显(P<0.05),对细胞增殖能力的抑制也更为显著(P<0.05)。结论 SH3GL2基因表达增高能够抑制Hep2细胞的增殖,促进细胞凋亡,并能够在一定程度上增强Hep2细胞对化疗药物DDP的敏感性。

SH3GL2基因在人脑胶质瘤中表达的研究

目的研究SH3GL2基因的表达改变与人脑胶质瘤之间的相关性。方法选择42例人脑胶质瘤和26例正常人脑组织标本,应用荧光定量PCR和Western blot方法检测标本中SH3GL2基因mRNA和蛋白的表达情况。结果与正常脑组织标本相比,SH3GL2基因在人脑胶质瘤组织标本中的mRNA和蛋白的表达存在明显下调,结果具有统计学差异(<0.05)。结论SH3GL2基因的表达改变与人脑胶质瘤相关,是一个新的候选的肿瘤抑制基因。

黄瓜遗传转化体系优化及表皮毛基因Gl的转化

选用黄瓜无毛突变体gl的子叶节为材料,对芽诱导阶段及根诱导阶段潮霉素的浓度进行筛选,分别确定2和3mg/L为其最适浓度;以pCAMBIA2301-gusA为载体,农杆菌GV3101介导,筛选出Silwet L-77(表面活性剂)的最佳体积分数为0.04%,侵染液浓度以原菌液(OD600=0.6)等倍稀释最佳;另外,对快速提取黄瓜DNA方法进行了优化。结果表明,添加500μL 0.5mol/L NaOH与200μL 100mmol/L Tris-HCl的组合最好。用优化的体系对表皮毛基因Gl进行遗传转化,获得7株阳性苗,为研究Gl基因的调控机制奠定了基础。

青少年特发性脊柱侧凸疾病候选基因SH3GL1外显子序列比对分析

目的通过对候选基因SH3GL1的核酸序列进行比对分析,确定其是否为青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的致病基因。方法采取以家系为基础的"病例同胞对"研究方案,提取基因组DNA,根据候选基因SH3GL1核酸序列,以10个外显子为重点设计引物对,进行PCR扩增、克隆和测序,用GeneTool软件对外显子测序结果进行序列比对分析,判断是否存在碱基变异,并进行蛋白质结构预测分析。结果候选基因SH3GL1中的10个外显子成功地在AIS"同胞对"基因组DNA中得到扩增和克隆,且序列测定均取得阳性结果。通过比对分析,在SH3GL1的10个外显子中共发现12处碱基变异,分别位于第2(3处)、4、5(4处)、6、8和10(2处,非编码区)六个外显子上。其中先证者mRNA第515位碱基如果为T,则形成终止密码子,导致蛋白阅读框发生改变,蛋白质序列预测分析显示编码截短蛋白,从而影响蛋白质的一级结构。结论SH3GL1是AIS的致病基因之一。

人GL50转基因细胞的构建及其生物学功能研究

目的构建稳定表达人GL50基因的小鼠成纤维母细胞L929细胞株,探讨GL50信号通路对T细胞的共刺激效应。方法Trizol一步法抽提人扁桃体细胞RNA,RT-PCR法扩增出GL50基因,双酶切装入逆转录病毒载体pEGZ-Term,与辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T,用其培养上清感染L929细胞72h,经Zeocin筛选出稳定表达GL50分子的L929细胞株;采用3H-TdR掺入实验观察GL50信号对T细胞体外培养的共刺激作用。结果成功构建含GL50基因的重组逆转录病毒载体,并获得含有GL50基因的重组病毒,筛选获得能稳定高表达人GL50分子的L929转基因细胞;该转基因细胞对体外培养的T细胞具有促增殖和活化作用;同时,GL50/ICOS信号与CD28/B7信号具有协同作用。结论GL50/ICOS信号在机体免疫应答过程中起重要作用;GL50转基因细胞的成功构建为进一步研究GL50分子功能奠定了良好基础。

棉花4个GL2同源基因的序列比较及表达分析

拟南芥GLABRA2(AtGL2)在决定拟南芥叶毛和根毛细胞的分化中起重要作用。通过同源序列查询从棉花的EST库中找到4个与AtGL2高度同源的全长编码序列(GhHOX1、GhHOX2、GhHOX3和GhHOX4)。序列分析表明4个棉花HOX基因与AtGL2基因Homeobox结构域相同氨基酸分别达到95%、71%、72%和63%。实时RT-PCR分析结果显示,GhHOX1、GhHOX3和GhHOX4均在伸长期的纤维中优势表达;而GhHOX3在开花当天野生型胚珠中的表达量明显高于无绒无絮突变体。说明棉花GL2同源基因在棉花纤维的起始和伸长中具有重要的调控作用。

水稻GL2型同源异形盒基因对表皮分化的作用

GL2型同源异形盒基因群属于影响植物表皮分化的一种同源异形盒基因群。为了分析这些基因在水稻表皮分化过程中所起的功能作用，我们分离出水稻的5个GL2型同源异形盒基因(Rocl-Roc5)，首先通过原位杂交方法分析了空间表达模式。结果查明。

转高赖氨酸融合蛋白基因水稻谷蛋白急性毒性

以我国自主培育的转高赖氨酸融合蛋白基因水稻(简称转GL基因水稻)为材料,参考中华人民共和国国家标准,通过小鼠急性经口毒性实验研究转GL基因水稻谷蛋白的食用安全性。采用低碱法(0.35%)提取的谷蛋白以5000mg/kg最大剂量灌胃小鼠,连续观察14d后测定小鼠体质量、血常规、脏器系数和脏器的病理学检查。结果表明:整个实验期间,小鼠生长状态良好,无死亡和异常现象;转GL基因稻米谷蛋白LD50>5000mg/kg,属实际无毒级别;各实验组间的小鼠体质量增长无明显差异,血常规指标、脏器系数和病理学检查也未见显著差异。因此,转GL基因水稻谷蛋白对小鼠无急性毒性作用。

转高赖氨酸融合蛋白基因水稻蛋白消化稳定性

以我国自主培育的转高赖氨酸融合蛋白基因水稻(简称转GL基因水稻)为材料,参考中华人民共和国国家标准,通过体外模拟胃/肠液消化实验,研究转GL基因水稻蛋白的消化稳定性。结果表明:质量浓度为5g/L的总蛋白在胃液中2min内完全消化,质量浓度为2g/L的总蛋白在肠液中15s～2min内完全消化;而以5倍于国标规定的质量浓度进行消化时,总蛋白在模拟胃液中60min仍可观察到未降解片段,在模拟肠液中2min内则全部消化;两步法体外模拟消化结果,胃液中极难降解的蛋白片段在经肠液作用5min后,完全被降解。本研究表明,转GL基因水稻蛋白在模拟胃肠液中不具有消化稳定性。

鼠源单抗3G1单链抗体基因的构建及序列分析

利用RT PCR方法 ,从分泌抗汉滩病毒mAb的杂交瘤细胞系 3G1中扩增出抗体VH 和VL基因 ,通过PCR方法获得linker VL 基因 ,进而利用加端PCR技术 ,在扩增出的单抗体VH 和linker VL基因两端加上限制性酶切位点 ,分别克隆入 pUC18中并测序 .3G1VH 基因长 36 0bp ,编码 12 0个氨基酸 ;VL 基因长 32 4bp ,编码 10 8个氨基酸 .在pUC18载体中将VH 和linker VL 基因连接成ScFv基因 .

海岛棉Gl2^e显性无腺体基因的精细定位

Gl2e基因是控制棉花植株和种子无腺体的一个基因,是低酚棉育种中一个重要的基因资源.本研究利用陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉无腺体突变品系海1构建的1599个F2单株,对无腺体突变基因Gl2e进行了精细定位.遗传研究进一步证明,该基因是一不完全显性单基因.结合本实验室的棉花海陆种间遗传连锁图谱,利用SSR标记将Gl2e基因定位在CIR362和NAU2251b,NAU3860b,STV033之间,遗传距离分别为9.27和0.96cM.

基因芯片检测难治性癫脑组织中sh3gl2的表达

目的:运用基因芯片和RT-PCR技术检测难治性癫脑组织中sh3gl2 mRNA表达,从分子水平探讨难治性癫可能的发病机制。方法:在应用基因芯片对难治性癫患者手术切除的颞叶组织与对照组行基因表达谱分析研究的基础上,筛选出目的基因后用RT-PCR对芯片扫描结果进行验证。结果:候选基因sh3gl2在难治性癫患者脑部颞叶组织中出现高表达,与对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01);RT-PCR结果与芯片结果一致。结论:sh3gl2在难治性癫颞叶皮质中的表达增加,提示了其可能是难治性癫发生发展中的一个重要因素。

水稻茸毛基因GL6的遗传学分析与精细定位

叶片表面茸毛是水稻形态学特征上的一个重要农艺性状,对水稻的生长及生理特性有着重要的影响.应用叶片具有茸毛特征的水稻品种75-1-127,无茸毛水稻品种明恢63,光身稻品种Lemont,9311分别杂交产生F1及F1自交产生的F2群体对水稻茸毛基因进行遗传学分析,结果表明,水稻茸毛性状为一对细胞核基因控制的显性性状.应用75-1-127/明恢63的F2隐性分离群体,结合分离群体分析法(BSA)和隐性群体分析法(RCA),并通过Mapmaker3.0/MapDraw软件分析,将水稻茸毛基因GL6初步定位在水稻第6号染色体上,位于SSR标记RM20491和RM20547之间,且两标记与该茸毛基因的相对遗传距离分别为7.2和2.2cM.进一步构建大的F2分离群体并同时挖掘新的SSR标记及插入缺失InDel标记用于茸毛基因GL6的精细定位,将茸毛基因GL6精细定位在插入缺失标记InDel-106和InDel-115之间,且两标记与该茸毛基因的相对遗传距离分别为0.3和0.1cM,结合GeneBank数据库分析,在该精细定位区域内,对应粳稻日本晴和籼稻9311的物理距离分别为79和116.82kb,分别注释有7个和8个预测基因,为进一步的基因克隆和功能研究奠定了基础.