实时定量聚合酶链反应法检测人周围血淋巴细胞受照后GADD45基因表达的改变

目的建立辐射诱导人淋巴细胞GADD45基因表达定量检测技术,探讨GADD45基因表达变化作为辐射生物剂量计的可行性。方法健康人周围血经X射线照射后分离淋巴细胞,提取总RNA,反转录成cDNA,利用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测GADD45基因经不同剂量照射(0～8 Gy)、2 Gy照后不同时间(0～72 h)的mRNA表达水平,以管家基因GAPDH为内参进行定量分析。结果照射后GADD45基因在转录水平表达呈剂量依赖性增加,4 Gy照射时达到峰值,8 Gy仍然保持在较高水平,GADD45基因表达改变存在线性剂量-效应关系,其线性回归方程为y^=3.408+1.528x,R2=0.787。2 Gy照射后GADD45基因mRNA表达在照射后1 h呈现上升趋势,在4 h时达峰值,照射后72 h基因表达仍未恢复到初始水平。结论实时荧光定量PCR检测GADD45基因表达方法具有良好的敏感性、重复性和剂量-效应关系,有可能成为新的辐射生物剂量计。

Gadd45基因表达调控对肿瘤发生的影响

恶性肿瘤发生发展机制是生命科学研究的热点方向。研究发现,Gadd45蛋白是重要的致癌应激反应因子,肿瘤细胞的存活受Gadd45α、Gadd45β和Gadd45γ蛋白的调节。另外,Gadd45蛋白也参加由环境和生理损伤引起的细胞周期紊乱、DNA损伤修复、细胞凋亡过程,同时在细胞发育过程中也起重要的作用。本文综述了Gadd45基因表达调控对肿瘤发生的影响。

老年小鼠脾细胞DNA修复能力的变化及gadd45和gadd153基因的可诱导性改变

目的：研究小鼠脾细胞ＤＮＡ修复能力的增龄变化以及这种变化的发生与损伤可诱导的ｇａｄｄ４５、ｇａｄｄ１５３基因表达的关联。方法：以紫外线损伤脾细胞ＤＮＡ，用非程序ＤＮＡ合成和单细胞凝胶电泳试验测定ＤＮＡ修复能力；用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法检测紫外线损伤后ｇａｄｄ４５、ｇａｄｄ１５３基因转录水平的变化。结果：老年小鼠脾细胞ＤＮＡ修复能力低于青年鼠，老年鼠ｇａｄｄ４５和ｇａｄｄ１５３基因的紫外线损伤的可诱导性也低于青年鼠。结论：小鼠脾细胞ＤＮＡ修复能力随增龄而下降，这种变化的发生可能与老年小鼠脾细胞在紫外线损伤后ｇａｄｄ４５、ｇａｄｄ１５３ｍＲＮＡ表达的可诱导性下降有关。

海风藤酮对老龄大鼠局灶性脑缺血DNA损伤修复相关基因GADD45表达的影响

目的:观察老龄大鼠局灶性脑缺血后DNA损伤修复相关基因GADD45表达的规律,探讨海风藤酮对神经细胞凋亡及GADD45表达的影响。方法:采用26月龄Wistar大鼠,经光化学诱导局灶性脑缺血后应用海风藤酮进行干预,观察不同时间和空间状态下GADD45蛋白表达的改变,同时运用TUNEL染色观察神经细胞的凋亡现象。结果:缺血4h组,在缺血中心区可见少许GADD45反应阳性细胞,而缺血周边区GADD45反应阳性细胞大量表达,较对照组差异有统计学意义(P<0.05)。缺血24h组,周边区GADD45表达较缺血4h有所降低,但仍高于假手术组(P<0.05),至缺血5d时,周边区GADD45表达较假手术组无明显差异。海风藤酮治疗组,缺血周边区TUNEL阳性细胞数较假手术组增多(P<0.05),但较对照组减少(P<0.05),而GADD45表达阳性细胞数较对照组增多(P<0.05),与假手术组比较增多(P<0.01)。结论:海风藤酮可有效保护缺血神经细胞,同时可以上调DNA修复基因GADD45的表达,减小DNA损伤的程度。

眼镜蛇毒因子耗竭补体对大鼠Thy-1肾炎凋亡病变及其Gadd45α基因表达的影响

目的:研究眼镜蛇毒因子(CVF)耗竭体内补体对Thy-1肾炎大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)凋亡病变及其生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45α(Gadd45α)基因表达的影响。方法:利用抗胸腺细胞抗血清(ATS)复制大鼠Thy-1肾炎(Thy-1 N)模型。大鼠随机分为正常对照组、Thy-1 N组和CVF+Thy-1 N组。取各组大鼠血清检测补体CH50活性。另取各组大鼠肾皮质,行电镜和TUNEL染色检查判断其肾组织细胞凋亡的病理变化;用RT-PCR和real-time PCR检测大鼠肾组织凋亡相关基因,即Gadd45α mRNA丰度;用Western blotting检测Gadd45α蛋白表达水平。结果:CVF+Thy-1 N组补体CH50活性明显下降,与Thy-1 N组和正常对照组相比差异明显(P<0.01)。电镜和TUNEL染色观察到Thy-1 N组大鼠GMCs有凋亡病变,而CVF+Thy-1 N组凋亡病变则显著减轻。Thy-1 N组大鼠肾皮质Gadd45α mRNA 40min开始上调,3h达到峰值,而用CVF处理的Thy-1 N大鼠,Gadd45α mRNA丰度则明显低于Thy-1N组(P<0.01);Thy-1 N组Gadd45α蛋白水平3h时显著增多,而CVF+Thy-1 N Gadd45α蛋白水平明显低于Thy-1 N组(P<0.01)。结论:CVF耗竭补体可显著减轻大鼠Thy-1肾炎凋亡病变并抑制Gadd45α基因的表达。

GADD45β基因表达诱导对不同p53状态的肝癌细胞作用

目的:体外合成GADD45β基因全序列表达质粒后,研究GADD45β基因表达诱导对呈不同p53状态的肝癌细胞的作用及可能机制。方法:采用RT-PCR法获得GADD45β基因全序列,插入pDrive穿梭克隆载体和pIRES2-EGFP荧光表达载体后大量扩增获得DNA,结合p53全基因表达质粒pp53-EGFP转染HepG2、Hep3B细胞后,以[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(3H-Tdr)和细胞克隆形成法分析DNA合成变化及细胞生长能力;以双抗体夹心ELISA法测定TGF-β1表达变化。结果:成功合成GADD45β基因全序列和表达质粒,通过流式细胞仪收集转染阳性的荧光表达细胞能显著提高转染效率;转染GADD45β后,具有野生型p53基因的HepG2细胞的细胞克隆形成能力和DNA合成能力明显受到抑制,细胞凋亡明显增加,TGF-β1的表达亦明显受抑。与之相反,缺失p53基因的Hep3B需要同时共转染p53基因后,方出现抑制效应。结论:GADD45β基因能够有效抑制肝癌细胞的生长,其功能需要完整p53基因的辅助和(或)调控。GADD45表达和(或)功能异常,导致p53介导的DNA损伤修复途径异常或阻断,是肝脏细胞恶性转化及形成肿瘤的可能机制。

Gadd45a基因对细胞调控作用的研究进展

细胞周期及生长的调控是细胞存活必不可少的,在细胞增殖及细胞周期控制有许多复杂的机制。Gadd45a基因为生长阻滞和DNA损伤修复基因,是重要的抑癌基因,是p53、BRCI基因调控的下游基因,调控细胞周期阻滞,细胞纺锤体检查点调控,DNA修复和诱导细胞凋亡。在细胞对外界损伤反应调控网络中扮有重要角色,在维持基因组稳定性和抑制肿瘤发生发展的过程中发挥重要的作用。Gadd45a作为控制癌细胞增殖代谢途径的重要组成部分,成为一个值得新兴的药物进一步研究靶点。

转录因子ATF3对大鼠Gadd45β/γ基因启动活性的影响及其可能的结合部位

目的 :构建大鼠生长阻滞及DNA损伤诱导基因45(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45)β/γ启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在大鼠肾小球系膜细胞(glomerular messangial cells,GMCs)中过表达激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)后分别对大鼠Gadd45β/γ基因启动活性的影响。同时筛选其可能的ATF3结合位点。方法:采用PCR技术,将扩增出的大鼠Gadd45β基因启动子全长(-1 105^+236 nt)和Gadd45γ基因启动子全长(-913^+72nt)分别插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得Gadd45β/γ基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-Gadd45β/γ-FL),再将p GL3-Gadd45β/γ-FL分别与课题组前期构建的大鼠野生型ATF3过表达质粒(p IRES2/ATF3)共转染GMCs,检测其荧光素酶活性,以确定ATF3对Gadd45β/γ基因的启动作用。另用生物信息学软件预测Gadd45β/γ基因启动子上ATF3潜在的结合位点,并据此构建4个Gadd45β和3个Gadd45γ基因启动子截短片段的荧光素酶报告质粒。将Gadd45β/γ基因启动子全长和各截短片段的荧光素酶报告质粒与p IRES2/ATF3共转染GMCs,再行荧光素酶活性测定,以筛选ATF3的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠Gadd45β/γ基因启动子(全长和截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-Gadd45β/γ-FL分别和p IRES2/ATF3共转染GMCs发现,Gadd45β/γ基因启动子活性均显著增加。而将Gadd45β启动子全长及4个截短质粒分别与p IRES2/ATF3共转染GMCs后显示,p GL3-Gadd45β-4的启动活性显著低于p GL3-Gadd45β-FL、p GL3-Gadd45β-1、p GL3-Gadd45β-2和p GL3-Gadd45β-3。提示ATF3可能结合在Gadd45β基因启动子的(-146^+23 nt)区域。同样,将Gadd45γ启动子全长及3个截短质粒分别与p IRES2/ATF3共转染GMCs后显示,p GL3-Gadd45γ-2、p GL3-Gadd45γ-3的启动活性显著低于p GL3-Gadd45γ-FL和p GL3-Gadd45γ-1。提示ATF3可能结合在Gadd45γ基因启动子的(-456^-61 nt)区域,且这段区域可能包含1个以上ATF3结合位点。结论:成功构建了大鼠Gadd45β/γ基因启动子全长及各截短片段荧光素酶报告质粒,并初步确定了ATF3在Gadd45β/γ基因启动子上的结合区域。

藏猪与大约克夏猪GADD45A基因多态性与表达差异研究

为了探究GADD45A基因在猪肌肉生长中的作用,试验选择180日龄的藏猪和大约克夏猪各8头,采用实时荧光定量PCR法测定和分析两品种试验猪只背最长肌、腿肌和垂体组织中GADD45A基因的mRNA相对表达量;同时选择180日龄藏猪37头和大约克夏猪55头,PCR扩增两品种试验猪只GADD45A基因起始密码子上游3 000 bp左右的序列(5′侧翼区),通过混池测序分析序列的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点,同时分析SNPs对GADD45A基因转录的影响。结果表明:在背最长肌和腿肌组织中,藏猪GADD45A基因的mRNA表达量均极显著高于大约克夏猪(P<0.01);在垂体组织中,藏猪GADD45A基因的mRNA表达量显著高于大约克夏猪(P<0.05)。GADD45A基因5′侧翼区存在G1 952A、C1 689T、G1 614T 3个突变位点,并且这3个突变位点在藏猪和大约克夏猪中均差异极显著(P<0.01),且均符合哈迪-温伯格定律(P>0.05);经转录因子预测,在C1 689T位点中,当C碱基突变为T碱基后,出现了新的转录因子——叉头框转录因子D3(forkhead box D3, FOXD3);在G1 614T位点中,当G碱基突变为T碱基后,转录因子——同源框CUT样蛋白1(cut like homeobox 1,CUX1)消失。说明上述突变位点可能是导致180日龄藏猪和大约克夏猪GADD45A基因mRNA相对表达量差异极显著或显著的原因,并推测该位点是调控GADD45A基因表达的关键功能位点。

宁乡猪GADD 45G基因多态性研究

本研究以宁乡猪为研究对象,用测序方法发现一个A→G类型SNP,采用PCR-RFLP-Pst Ⅰ进行分型。结果表明:宁乡猪GADD45G基因A/G位点的AA型、AG型和GG型频率分别为0.08、0.73和0.19,A基因和G基因频率分别为0.45和0.55,这表明宁乡猪该位点基因型基本处于杂合状态。本研究为宁乡猪的保种选育积累了有益的资料。

贵州白香猪Gadd45G的cDNA克隆与序列分析

采用试剂盒提取RNA和RT-PCR法获得贵州白香猪Gadd45G基因cDNA序列,构建了贵州白香猪Gadd45G基因的pMD19亚克隆载体,并对该重组质粒进行测序分析,为贵州白香猪作为模式动物提供理论基础,为构建Gadd45G基因真核表达载体和转基因猪研究奠定基础。PCR、双酶切鉴定结果表明,已成功克隆的贵州白香猪Gadd45G基因的cDNA序列长度为480 bp。测序结果显示,贵州白香猪Gadd45G基因cDNA序列与普通猪、人类、家鼠、牛的同源性分别为99.6%、89.6%、90.2%、91.2%,氨基酸同源性分别为98.8%、95.6%、95.0%、96.2%。序列分析表明,贵州白香猪Gadd45G基因编码序列与普通猪相比,有两处发生碱基突变,其中一处为错义突变(第385处的G→A突变)使氨基酸由丙氨酸突变成苏氨酸。

XPD对SMMC-7721肝癌细胞中DNp73和GADD45β的调控及意义

目的:观察人剪切修复基因人类着色性干皮病D组基因(xeroderma pigmentosum group D,XPD)转染至人肝癌细胞株SMMC-7721细胞后XPD、DNp73和GADD45β基因的表达变化以及对肝癌细胞生长的影响.方法:实验分4组:重组质粒SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD(XPD组)、空载质粒SMMC-7721-pEGFP-N2组(N2组),脂质体组和SMMC-7721细胞空白对照组.应用Lipofectamine2000脂质体瞬时转染,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)法检测转XPD基因后,人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中DNp73以及GADD45β的mRNA和蛋白质的表达量变化,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖的活力,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果:荧光显微镜下,XPD组和N2组细胞中观察到绿色荧光蛋白表达,说明转染成功;RT-PCR检测显示:XPD组中DNp73 mRNA相对表达量较其他3组显著下调,XPD和GADD45βmRNA相对表达量较其他3组明显上调(均P<0.01);Western blot检测显示:XPD、DNp73以及GADD45β蛋白相对表达量在各组间的差异与其mRNA各组间差异一致;MTT检测示:SMMC-7721细胞空白对照组、脂质体组、N2组、XPD组的吸光度(A)值分别为0.633±0.012,0.623±0.009,0.628±0.016,0.384±0.011,XPD组低于其他3组,差异均有统计学意义(均P<0.01),表明转染XPD后SMMC-7721细胞的增殖能力减弱.流式细胞仪检测SMMC-7721肝癌细胞凋亡:转染XPD的SMMC-7721细胞凋亡显著,凋亡率达56.53%,而其他3组均未见明显凋亡.结论:XPD基因在肝癌的发生发展中起抑制作用,癌基因DNp73的表达随XPD表达增加而降低,抑癌基因GADD45β则随XPD表达增加而增加,提示两者可能在XPD抑制肝癌细胞的生长机制中起重要作用.

GADD45A与肿瘤治疗

生长阻滞和DNA损伤基因45A(growth arrest and DNA damage-inducible 45A,GADD45A)是第1个被发现的由P53激活的应激诱导基因,同时也是P63、P73、BRCA1及MYC的靶标基因。GADD45A作为DNA损伤修复基因,受P53依赖(电离辐射诱导)和独立于P53(紫外线诱导)的途径调节,参与DNA损伤修复、细胞周期阻滞、凋亡、自噬、血管形成等生物学功能,与肿瘤发生发展密切相关。在大多数肿瘤的治疗中,化疗药物直接或者间接(如脱甲基化、乙酰化)上调其表达水平,提高癌细胞药物敏感性;同时,在放射治疗过程,过表达GADD45A可干预放射抵抗。然而,在少数肿瘤的治疗中,GADD45A的表达反而能够提高癌细胞的存活率。本文主要对GADD45A在肿瘤治疗中所发挥的作用及机制进行综述。

^(60)Coγ射线诱发人外周血GADD45A基因表达的变化研究

目的探讨电离辐射诱导人外周血GADD45A基因的表达变化,为寻找急性照射条件下辐射损伤早期诊断标志物提供实验依据。方法采集无急慢性疾病、不抽烟、年龄在26～29周岁的3名男性非放射性工作者外周血各10ml,分为10组,每组1ml。利用中国辐射防护研究院60Co照射装置对采集的血样分组照射,剂量率为0.313Gy/min。吸收剂量分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2和3 Gy,照射后的人外周血于37℃培养箱中静置2h后提取RNA,利用实时荧光定量PCR技术对外周血GADD45A基因进行检测。结果实时荧光定量PCR检测结果表明各剂量组与对照组相比,其基因表达均有显著变化。0.05～0.6Gy剂量组与对照组相比基因表达下调,其中0.05～0.2Gy之间,随着照射剂量的增加,基因表达量逐渐降低;0.2～0.6Gy之间,随着照射剂量的增加基因表达量又逐渐增加。0.8Gy时,基因表达量增幅较大,高于对照组和1Gy剂量组。1～3Gy剂量组基因表达量均高于对照组,且随着剂量增大,表达量增加,具有明显剂量相关性。结论电离辐射可以诱导人外周血GADD45A基因的差异表达,1～3Gy之间具有明显剂量相关性。0.05～0.2Gy之间外周血淋巴细胞表现出辐射刺激效应。

^(137)Cs γ射线慢性照射诱导大鼠外周血GADD45A基因表达变化的研究

目的探讨长期慢性照射条件下辐射诱导的大鼠外周血GADD45A基因的表达变化。方法将SD大鼠置于137Cs放射源下累积照射,吸收剂量分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4和5Gy,照射完成组禁食2 h后腹主动脉采血,利用实时荧光定量PCR检测外周血GADD45A基因的表达变化。结果各剂量组与对照组相比,其外周血GADD45A基因表达均有显著变化,整体上随照射剂量的增加,基因表达量具有一定的上升趋势。其中,0.05Gy剂量组与对照组相比表达增高。随着照射剂量的增加及照射时间的延长,GADD45A基因的相对表达量有所回落,当剂量达0.4Gy后该基因表达减至最低点。之后随照射剂量的增大,各剂量组与对照组相比具有不同程度的升高,4Gy照射组的GADD45A基因表达增强最显著。结论慢性累积照射可诱导大鼠外周血GADD45A基因表达发生改变,其总体表达趋势是增强的。

Gadd45与基因组稳定性

Gadd45基因是生长抑制及DNA损伤诱导基因家族中的一员，是电离辐射效应基因之一，在细胞周期调控、DNA损伤修复及细胞凋亡过程中发挥重要作用，这使它成为维持基因组稳定性的重要基因，在肿瘤细胞存活、凋亡信号通路中发挥错综复杂的作用，从而参与肿瘤的发生和发展。

中药复方“金复康”抑制肺癌细胞生长机制的研究

目的:本文主要探讨中药复方金复康萃取物对人非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)A549细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法:本文以人非小细胞肺癌A549细胞为研究对象,应用CCK8试剂盒检测了金复康萃取物对细胞增殖活力的影响,流式细胞技术检测金复康对细胞凋亡诱导作用,实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(Real-time q PCR,RT-q PCR)检测细胞凋亡相关基因的表达。结果:金复康萃取物对A549细胞增殖有较显著抑制作用,并且存在剂量依赖效应。与对照组相比,金复康处理组细胞数量明显减少,伴随着大量细胞间距增大,失去原有形态,DAPI细胞核染色结果显示细胞核受到损伤。流式细胞检测实验显示金复康明显诱导A549细胞凋亡。RT-q PCR检测发现金复康上调凋亡相关基因转录表达水平。结论:金复康通过诱导细胞凋亡抑制A549细胞增殖,这一过程可能与其诱导凋亡相关基因FADD和GADD45a表达上调有关。