成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证

背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系。本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验证。方法:以SOSP-9607细胞作为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),多聚腺苷酸化和5′连接子连接后,通过RT-PCR进行反转录和扩增,克隆到pCR4-TOPO载体上得到大约109bpDNA片段,测序后经过生物信息学分析确定miRNA的表达情况。根据当前miRNA的研究现状,在克隆到的miRNA中选取部分功能性miRNA和新发现miRNA,合成相应探针后与从SOSP-9607细胞、HeLa细胞和成骨肉瘤组织中分离出的小片段RNA进行Northern印迹验证。结果:克隆测序后得到182个克隆体,经生物信息学分析发现有47个miRNA(25种),其中含有23种已知的miRNA和2种Nature杂志上预测的miRNA(miR-165和miR-166)。选取的三条实体瘤相关的miRNA(miR-21、miR-20a、miR-17-5p)以及两条预测的miRNA进行Northern印迹验证,miR-21、miR-20a、miR-17-5p在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中均表达,预测的miR-165和miR-166在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中亦均表达,但miR-166在HeLa细胞中没有表达。结论:克隆了SOSP-9607细胞中的miRNA,并验证了部分功能性miRNA的表达,提示miRNA与肿瘤发生可能有密切的关系。

人类新型β3半乳糖基转移酶基因β3GalT7的克隆和鉴定

从人肺cDNA文库中克隆到人类β3-半乳糖基转移酶家族中的一个新成员β3GalT7(AY277592,EC2.4.1.-),并对其进行了鉴定. 该基因定位在人类染色体19q13.2. 它包含一个1 191 bp的开放阅读框(ORF). 编码的蛋白质包括一个信号肽和一个半乳糖基转移酶结构域,分子质量和等电点分别为43.3 ku和8.37. 从原核表达中获得的融合蛋白的分子质量和预测相符. RNA印迹杂交显示β3GalT7在肺、喉和回肠组织中高表达,而在舌、乳房、子宫、睾丸等组织中表达较低. 此外半定量RT-PCR显示β3GalT7在人类不同的肿瘤细胞中转录水平有明显差异.