巨型艾美球虫gam56基因的截短原核表达及其产物的免疫保护效果

为评价gam56基因重组表达产物作为亚单位疫苗预防鸡巨型艾美球虫(E.maxima)感染的效果,以E.maximaNT株配子体总RNA为模板,RT-PCR扩增和克隆gam56基因,选择该基因两段含丰富抗原表位的编码区片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1在大肠杆菌中进行截短表达。以可溶性的GST-gam56-2融合蛋白为免疫原,设立高、中、低(1.0mg、0.5mg、0.25mg)3个剂量,单独或使用弗氏完全佐剂,于5d、12d和19d对雏鸡进行3次免疫,26d用5×104个E.maxima孢子化卵囊进行攻虫,8d后迫杀,对各组的存活率、相对增重率、卵囊减少率、ACI等指标进行统计分析。结果显示:就相对增重率而言各免疫组比未免疫攻毒组的高27.6%以上,而各免疫组之间差异不显著(p>0.05);就卵囊减少率指标而言,各免疫组较未免疫攻毒组均有不同程度减少,但是均小于75%;就ACI指标而言,各免疫组较未免疫攻毒组均有不同程度增加,以中剂量蛋白佐剂组为最高。GST-gam56-2融合蛋白对于E.maxima感染具有一定的免疫保护效力。

鸡堆型艾美耳球虫gam56基因的克隆及其表达产物的免疫原性分析

为了研究堆型艾美耳球虫gam56基因的功能,提取堆型艾美耳球虫(扬州株)卵囊DNA,应用PCR扩增gam56基因,克隆至pGEM-T-Easy载体;测序、密码子优化后连接至pET-28a质粒,构建pET-28aEagam56表达载体,转化至大肠杆菌BL21;重组菌经酶切和测序鉴定后诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果显示:gam56基因全长1 323 bp,编码440个氨基酸;重组蛋白大小约49 ku,以可溶蛋白形式为多,能被组氨酸单抗特异性识别;该重组蛋白能被小鼠抗重组蛋白多克隆抗体以及鸡抗堆型艾美耳球虫、鸡抗毒害艾美耳球虫、鸡抗巨型艾美耳球虫和鸡抗柔嫩艾美耳球虫的阳性血清特异性识别。本研究结果为进一步探析堆型艾美耳球虫gam56基因功能与研制鸡球虫病基因工程疫苗奠定了基础。