幽门螺杆菌感染通过核因子κB信号通路调控Fas相关因子1表达的相关机制

目的:探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染对敲除核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路上IKKβ、p65基因后过表达Fas相关因子1(Fas-associated factor 1,FAF1)胃癌细胞的影响,进一步明确H.pylori致癌的相关机制.方法:构建针对IKKβ、p65的siRNA慢病毒载体(LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi),转染过表达FAF1的HGC-27细胞,实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)法检测转染前后IKKβ、p65、FAF1 mRNA和蛋白表达.应用CCK8法检测转染后细胞增殖能力的变化.用H.pylori培养滤液感染基因敲除细胞,用RT-PCR和Western blot法检测H.pylori感染前后IKKβ、p65、FAF1 mRNA和蛋白表达.结果:成功将LV-IKKβ-RNAi、LV-p65-RNAi和阴性对照(LV-NC-RNAi)转染入过表达FAF1胃癌细胞,转染后72 h,LV-IKKβ-RNAi和LV-p65-RNAi组IKKβ和p65 mRNA和蛋白表达显著低于LV-NC-RNAi组和未转染组(均P<0.01);转染前后各组间FAF1 mRNA和蛋白表达无显著差异(P>0.05).LV-IKKβ-RNAi组和LV-p65-RNAi组细胞增殖能力升高(P<0.01).H.pylori感染后LV-IKKβ-RNAi组和LV-p65-RNAi组IKKβ、p65 mRNA和蛋白表达与感染前相比无显著差异(P>0.05),而LV-NC-RNAi组和未转染组IKKβ、p65 mRNA和蛋白表达都显著高于感染前(P<0.01).H.pylori感染后LV-IKKβ-RNAi组和LV-p65-RNAi组FAF1 mRNA和蛋白表达与感染前相比无显著差异(P>0.05),而LV-NC-RNAi组和未转染组FAF1 mRNA和蛋白表达显著低于感染前(P<0.01).结论:H.pylori感染可能通过介导NF-κB信号通路下调抑癌因子FAF1的表达,进而导致胃癌的发生.

FAP-1反义寡核苷酸联合卡铂对卵巢癌细胞SKOV3凋亡的作用

背景与目的实验已证明,Fas相关磷酸酯酶-1(FAP-1)在卵巢癌细胞SKOV3中有高表达,可能对卵巢癌的发病与耐药具有重要意义。本研究应用反义核酸技术探讨FAP-1反义寡核苷酸(FAP-1ASODN)联合卡铂对SKOV3细胞凋亡的作用。方法反义核苷酸技术将FAP-1ASODN转染SKOV3细胞。采用逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测转染前后FAP-1mRNA的表达,采用流式细胞术(FCM)分析细胞周期与细胞凋亡率,噻唑蓝法(MTT法)测定FAP-1ASODN与40μg/ml卡铂共同作用后对SKOV3细胞生长的影响。结果经FAP-1ASODN处理24h后,与对照组及FAP-1正义寡核苷酸(SODN)组比较,反义组的FAP-1mRNA表达明显减弱。FCM结果显示,卡铂+FAP-1ASODN组在24～72h的细胞凋亡率明显高于单用ASODN组及单用卡铂组,差异有显著性(P<0.05),且可将细胞周期阻滞于G1期;MTT结果显示,卡铂+FAP-1ASODN组12～96h的细胞抑制率约为单用ASODN组的1.5～2倍,约为单用卡铂组的1.5倍,明显高于后两者,差异有显著性(P<0.05);而在单用卡铂组与卡铂+FAP-1SODN组间无显著性差异(P>0.05)。结论FAP-1ASODN转染可以有效抑制FAP-1基因的表达,同时可以增强卵巢癌细胞对卡铂诱导凋亡的敏感性。

FAF1 mRNA在胃癌组织中的表达及其与幽门螺杆菌感染的相关性

目的:探讨FAF1 mRNA在胃癌组织中的表达水平及其临床意义以及与幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染的相关性.方法:应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对40例胃癌患者及相应正常胃黏膜组织中的FAF1mRNA进行定量检测,以β-actin为内参照.H.pylori采用HE染色、甲苯胺蓝染色和Warthin-Starry银染法进行检测.结果:胃癌组织中FAF1 mRNA的表达明显低于相应正常胃黏膜组织(0.27±0.12vs0.48±0.08,P<0.05).高、中分化的胃癌组织FAF1mRNA表达值明显高于低、未分化的胃癌组织(0.39±0.06vs0.19±0.06,t=9.966,P<0.01).有远处转移的胃癌组织FAF1 mRNA表达值低于无远处转移的胃癌组织(0.25±0.11vs0.34±0.14,t=-2.753,P<0.01),而FAF1 mRNA表达水平在浸润深度、有无淋巴结转移、肿瘤大小及临床分期不同的胃癌组织中无显著性差异.FAF1 mRNA表达量在H.pylori阳性胃癌组织中明显低于H.pylori阴性(0.18±0.06vs0.29±0.12,P<0.05).FAF1表达量在H.pylori阳性正常胃黏膜组织中与H.pylori阴性比较无显著差异(0.49±0.08vs0.47±0.11,t=0.6515,P>0.05).结论:FAF1基因的表达异常可能与胃癌的发生发展有关,H.pylori感染可能通过下调FAF1基因的表达而发挥致癌作用.

过表达FAF1对胃癌细胞HGC-27增殖及凋亡的影响

目的:检测过表达F a s相关蛋白1(F a sassociated factor 1,FAF1)对胃癌细胞HGC-27增殖及凋亡的影响,探讨FAF1与胃癌发生发展的相关性.方法:实验分为阴性对照组(未转染组)、空载转染组(感染空载体慢病毒颗粒1.0×108TU/mL)、过表达FAF1组(感染FAF1过表达慢病毒颗粒1.0×108TU/mL).激光共聚焦显微镜观察转染效率,Western blot检测FAF1蛋白的表达情况,透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况,MTT检测细胞生长情况.结果:依据GFP绿色荧光可测定细胞转染效率达95%以上;与阴性对照组和空载转染组相比,过表达FAF1组FAF1蛋白明显高表达;阴性对照组和空载转染组均细胞膜完整,细胞核正常,两者超微结构无明显差异,而过表达FAF1组胞核裂解成碎片状,可见凋亡小体形成;FAF1过表达能够抑制人胃癌细胞HGC-27的增殖,诱导细胞凋亡,改变细胞周期的分布,与阴性对照组和空载转染组相比,过表达FAF1组细胞的倍增时间显著延长,细胞凋亡率显著提高(84.66%±5.92%vs 4.60%±3.80%和7.32%±3.82%,P<0.05),G0/G1期细胞显著降低(46.43%±2.43%vs 54.93%±3.5%和54%±0.3%,P<0.05),G2/M期细胞显著增多(29.78%±3.91%vs 19.33%±3.82%和20.93%±2.46%,P<0.05),差异均有统计学意义.结论:构建的过表达FAF1慢病毒可以抑制胃癌细胞的生长,改变细胞周期的分布,促进胃癌细胞的凋亡.

人胃癌组织中FAP-1的表达及意义

为了探讨FAP-1在胃癌中的表达与细胞增殖和凋亡的关系及其临床意义,采用免疫组化SP法检测40例胃癌、20例胃良性肿瘤及10例正常胃粘膜组织中:FAP-1蛋白的表达水平。结果表明FAP-1蛋白的阳性表达主要定位在细胞浆内,少数也可见于核周。FAP-1蛋白在正常胃粘膜组织中呈阴性表达,胃良性肿瘤中的表达率为20%(4/20),胃癌中的阳性表达率70%(28/40),与前两者相比差异有显著性(P<0.01),而对照组与胃良性肿瘤组无显著性差异(P>0.05)。FAP-1的表达与胃癌的病理分化相关,而与年龄、性别、肿块大小、转移性无明显相关性。

FAP-1在卵巢癌细胞株中的表达与意义

目的 :探讨Fas相关磷酸酯酶 -1(FAP 1)在卵巢癌细胞株SKOV3、HO 8910、TC 1和 3AO中的表达与意义。方法 :采用免疫印迹法和逆转录聚合酶链式反应方法 ,检测了 4种卵巢癌细胞株中FAP 1蛋白与核酸的表达水平 ;应用四唑盐比色法和流式细胞术检测了经抗Fas激活性抗体DX2诱导凋亡后 ,FAP 1分子与 4种细胞对凋亡敏感性的关系。结果 :FAP 1蛋白与mRNA的表达结果一致 ,均在SKOV3和HO 8910细胞中有表达 ,以SKOV3表达最强 ,而在TC 1和 3AO中未见表达。当用DX2以不同时间诱导凋亡后 ,FAP 1阴性株的细胞抑制率与凋亡率均高于FAP 1阳性株 ,P<0 0 5 ,P <0 0 1;而FAP 1阳性株中 ,HO 8910的生长抑制率又高于SKOV3 ,P <0 0 5。同时 ,FAP 1阴性株对DX2的反应具有时间依赖性 ,而FAP 1阳性株却表现出对DX2的逐渐耐受性。结论 :FAP 1对细胞凋亡的敏感性具有负性调控作用 。

FAP-1在乳腺癌中的表达及意义

目的:研究Fas相关磷酸酯酶-1(FAP-1)在乳腺癌组织中的表达及其与临床分期、病理分级、淋巴结转移和患者年龄的关系。方法:SP法检测正常乳腺组织、乳腺癌及乳腺良性肿瘤组织中FAP-1蛋白的表达水平。结果:FAP-1蛋白在正常乳腺组织中未见表达,在良性肿瘤中的表达率为26%,在交界性肿瘤与恶性肿瘤中的阳性表达率分别为69%和80%;FAP-1蛋白的表达与乳腺癌的临床分期、病理分级和淋巴结转移状况有关,而与年龄无关。结论:FAP-1在乳腺癌组织中广泛表达,可能成为判断乳腺癌恶变程度及预后的重要指标。

不同浓度幽门螺杆菌对胃癌细胞增殖凋亡及FAF1 mRNA表达的影响

目的研究不同浓度幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)感染对人胃癌细胞HGC-27生长及Fas相关因子1(fasassociated factor 1,FAF1)m RNA表达的影响,探讨Hp致胃癌发生的分子机制。方法人胃癌细胞HGC-27与不同浓度Hp标准菌株NCTC11637共培养24 h,根据感染复数(细胞/细菌比)分为1∶1共培养组、1∶50共培养组、1∶100共培养组、1∶200共培养组及对照组(未与Hp共培养),采用噻唑蓝(MTT)比色法测定0 h、12 h、24 h、48 h的OD值,绘制细胞生长曲线。共培养24 h后以流式细胞仪检测细胞凋亡率,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)技术检测HGC-27细胞FAF1 m RNA的相对表达量,比较不同浓度Hp感染前后FAF1 m RNA表达的变化。结果经革兰氏染色及生化实验证实培养细菌为Hp。与对照组相比,共培养12 h时,1∶50共培养组细胞增殖活性升高(P<0.05),1∶1共培养组、1∶100共培养组及1∶200共培养组细胞增殖活性低于对照组(P<0.05);共培养24 h、36 h、48 h时,各共培养组细胞增殖活性均低于对照组(P<0.05)。共培养24 h时,1∶1共培养组及1∶50共培养组细胞凋亡率及FAF1 m RNA的相对表达量与对照组比较,差异无统计学意义(P均>0.05);1∶100共培养组及1∶200共培养组细胞凋亡率明显升高,FAF1 m RNA的相对表达量较对照组明显降低(P<0.05)。结论 Hp感染可导致胃癌细胞增殖凋亡失衡,下调胃癌细胞FAF1 m RNA的表达,FAF1m RNA的表达量与Hp的感染浓度有关,FAF1 m RNA的表达下调可能是Hp致胃癌发生的机制之一。

胃癌组织中c-FLIP、NF-κBp65的表达变化及意义

目的探讨细胞型Fas相关的死亡区域蛋白样白介素-1转换酶抑制蛋白(c-FLIP)、细胞核因子κB(NF-κB)在胃癌发生、发展中的作用。方法选择胃癌组织标本80份(胃癌组)和癌旁组织80份(癌旁组),采用免疫组化法检测两组的c-FLIP、NF-κB p65,分析其与胃癌临床病理特征的关系。结果胃癌组c-FLIP、NF-κB p65阳性率明显高于癌旁组(P均<0.05);c-FLIP的表达与胃癌临床分期、分化程度、淋巴结转移、术后复发相关(P均<0.05),NF-κB p65的表达与浸润深度、分化程度、淋巴结转移、术后复发相关(P均<0.05);c-FLIP和NF-κB p65在胃癌组织中的表达呈正相关(r=0.303,P=0.006)。结论 c-FLIP、NF-κB p65的高表达可能在胃癌的发生、发展中起重要作用。

结肠癌转移相关基因-1通过调控肝细胞生长因子-酪氨酸激酶受体信号通路对体外胃癌细胞株MGC-803生物学功能的影响

目的 观察结肠癌转移相关基因-1（MACC-1）表达对体外胃癌细胞株MGC-803的增殖凋亡和生物学功能的影响.方法 培养胃癌MGC-803细胞,将传代的细胞分为以下3组：A组：MACC-1-短发卡RNA （shRNA）和PSV2neo3共转染组,B组：shNC和PSV2neo共转染组,C组：未转染组,A组为实验组,B、C两组为阳性对照组和阴性对照组.通过Western blot和实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测MACC-1蛋白和mRNA在3组细胞中的表达水平,并检测3组MGC-803细胞中酪氨酸激酶受体（c-Met）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）和mRNA水平表达变化,并通过流式细胞法和划痕实验观察比较转染MACC-1-shRNA的MGC-803细胞的的迁移能力和增殖凋亡情况.结果 （1）Westem blot和Real-time PCR检测结果显示：与B、C组比较,MACC-1-shRNA组MACC-1蛋白及mRNA表达均显著下调（P＜0.01）,c-Met蛋白及其mRNA的表达显著下调（P＜0.01）.（2）Western blot和Real-time PCR检测结果显示：与B、C组比较,A组上皮标志物E-cadherin蛋白和及mRNA表达显著上调（P＜0.01）,c-Met蛋白及其mRNA,间质细胞标志物N-cadherin蛋白及mRNA的表达显著下调（P＜0.01）,B、C两组间E-cadherin和N-cadherin蛋白及mRNA表达的差异无统计学意义（P＞0.01）.（3）划痕实验检测细胞迁移：结果表明,A组划痕间距较宽,愈合被抑制,MGC-803细胞迁移能力低于B、C细胞（P＜0.01）,B、C两组细胞的划痕间距差异无统计学意义（P＞0.01）.（4）流式细胞仪分析细胞凋亡：A、B和C组细胞的凋亡率分别为（21.06＆#177;1.12）％、（2.18＆#177;0.14）％和（2.04＆#177;0.11）％,A组细胞的凋亡率较C组明显增加（P＜0.01）,B、C两组细胞凋亡的差异无统计学意义.结论 MACC-1基因转染对体外胃癌细胞株MGC-803细胞具有促进增殖和抑制凋亡作用,其可能是通过调控肝细胞生长因子（HGF）/c-Met信号转导通路来发挥作用.

下调XB130表达对胃癌HGC-27细胞增殖及凋亡的影响

【目的】观察下调肌动蛋白丝相关蛋白1相似蛋白2(actin filament-associated protein 1-like 2,XB130)表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响并探讨其机制。【方法】以Western blotting及q RT-PCR检测4种胃癌细胞株(HGC-27、KATOⅢ、N87、SNU-1)中XB130表达水平;构建小RNA干扰质粒si XB130,转染HGC-27细胞,以Western blotting及q RT-PCR检测转染效率及转染后凋亡相关基因(Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3)表达水平;MTT法检测转染后细胞增殖,流式细胞术检测转染后细胞凋亡。【结果】4种胃癌细胞株中XB130蛋白及m RNA均有表达,其中以HGC-27细胞表达水平最高。转染si XB130至HGC-27细胞后显示,si XB130组细胞增殖率在72 h及96 h低于MOCK组及si NC组(F=3.991,P<0.05;F=2.804,P<0.05),而凋亡率则高于MOCK组及si NC组(F=14.261,P<0.001);与MOCK及si NC组对比,si XB130组中Cleaved-PARP蛋白及m RNA表达水平降低,CleavedCaspase3则升高。【结论】下调胃癌细胞XB130表达可抑制增殖和促进其凋亡,XB130可作为胃癌治疗靶向候选基因。

长链非编码RNA MACC1-AS1调控AKT/m TOR通路介导胃癌顺铂耐药的研究

目的探讨长链非编码RNA结肠癌相关转移基因1反义RNA(metastasis-associated in colon cancer 1-antisense RNA,MACC1-AS1)在顺铂耐药胃癌中的作用及其可能机制。方法选取人胃癌细胞株BGC823和顺铂耐药胃癌细胞BGC823/DDP为研究对象。对BGC823/DDP细胞进行转染,分为阴性对照组(si-NC组,转染si-NC空质粒)和MACC1-AS1基因沉默组(si-MACC1-AS1组,转染si-MACC1-AS1质粒);同时对BGC823细胞进行转染,分为阳性对照组(pcDNA-NC组,转染pcDNA-NC空质粒)和MACC1-AS1基因过表达组(pcDNA-MACC1-AS1组,转染pcDNA-MACC1-AS1质粒)。采用MTT法检测细胞增殖抑制情况和细胞半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC_(50))值;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用实时荧光定量PCR检测细胞中MACC1-AS1、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关的X基因(Bax)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR,p-mTOR)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和磷酸化AKT(phosphorylated AKT,p-AKT)的mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞Bax、Bcl-2、p-mTOR、mTOR、AKT和p-AKT蛋白表达水平。结果BGC823/DDP细胞中MACC1-AS1 mRNA的相对表达量高于BGC823胃癌细胞(P<0.01);si-MACC1-AS1组细胞中MACC1-AS1 mRNA相对表达量低于si-NC组(P<0.001);pc DNA-MACC1-AS1组细胞MACC1-AS1 mRNA相对表达量高于pc DNA-NC组(P<0.0001)。si-MACC1-AS1组的细胞生长抑制率和IC_(50)值均高于si-NC组(P<0.001);pcDNA-MACC1-AS1组的细胞生长抑制率和IC_(50)值均低于pcDNA-NC组(P<0.001)。pcDNA-MACC1-AS1组细胞的Bcl-2、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的蛋白和mRNA相对表达量均高于pcDNA-NC组(P<0.01),Bax蛋白和mRNA相对表达量低于pcDNA-NC组(P<0.01);pcDNA-MACC1-AS1组的细胞凋亡率低于pcDNA-NC组(P<0.01)。si-MACC1-AS1组细胞的Bcl-2、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的蛋白和mRNA相对表达量均低于si-NC组(P<0.01),Bax蛋白和mRNA相对表达量高于si-NC组(P<0.01);si-MACC1-AS1组的细胞凋亡率高于si-NC组(P<0.01)。结论MACC1-AS1在顺铂耐药的胃癌细胞中高表达,MACC1-AS1过表达调控AKT/mTOR通路介导的细胞凋亡,增强胃癌细胞对顺铂的耐药性。