蛋白质组研究中的二维电泳分离技术

对目前生命科学研究中的热点领域蛋白质组研究中应用的主要分离技术二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理、应用和最新进展进行了综述。同时,针对二维凝胶电泳的缺陷,介绍了目前正在发展的几种替代技术。

金钱白花蛇可溶性蛋白凝胶电泳图谱的研究

对金钱白花蛇进行几种凝胶电泳研究 ,根据聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)谱带的位置和数目进行品种鉴别 ;用改进的十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)测定其主要蛋白质成分分子量 ;用等电聚焦电泳(IFE)测定其主要蛋白质成分的等电点 (PI)。清晰的电泳谱带及相应数据为商品蛇真伪鉴别提供了科学依据。

毛细管等电聚焦/毛细管无胶筛分电泳二维蛋白质分离平台的构建

设计并制作了一种新型的中空纤维接口 ,以此为核心构建了毛细管等电聚焦 (CIEF) /毛细管无胶筛分 (CNGE)电泳二维蛋白质分离技术平台 ,实现了将二维凝胶电泳从平板转移到毛细管中。利用该二维分离平台 ,对血红蛋白样品进行了高效、快速分离分析 ,验证了该二维分离平台的可行性及分离效能。实验结果表明 :二维分离系统总的峰个数和分离效能都比各自一维分离系统有较大提高。

海南产桶形芋螺蛋白质二硫键异构酶的鉴定

蛋白质二硫键异构酶(PDI)是内质网新生肽链折叠中一个重要的折叠酶.在热带药用海洋生物芋螺的毒液中富含PDI酶,该酶对于毒液中芋螺毒素神经肽的体内氧化折叠至关重要.本研究主要采用凝胶过滤层析和制备型Rotofor液相等电聚焦电泳等多种方法,从海南产桶形芋螺(Conus betulinusLinnaeus)毒管中分离纯化天然的PDI酶蛋白,经电泳和MALDI-TOF MS质谱鉴定分析确证获得了高纯度的桶形芋螺PDI酶,建立了天然芋螺PDI酶分离纯化的技术方法.以芋螺毒素线性肽K412为底物进行了PDI酶活性鉴定.结果表明,该分离纯化的PDI酶能够促进K412的氧化折叠.由于芋螺毒素的氧化折叠非常复杂,且氧化折叠后具有正确二硫键连接方式的芋螺毒素才具有各种药理活性,因此,本研究结果为后续PDI酶在种类繁多的芋螺毒素氧化折叠中的应用及其作用机制研究提供了重要的物质基础.

上海地区胃癌病人运铁蛋白(Tf)、组特异性成分(Gc)、α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)亚型分布的研究

用薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳分析了上海地区202例汉族胃癌病人及202例正常对照组的运铁聋白(Tf)和α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)亚型的分布,发现胃癌组Tfc_1c_1纯合子频率(0.3713)和Tfc_1基因频率(0.5718)显著低于对照组(分别为0.5149和0.6782),均为p<0.01,胃癌组Tfc_2c_2纯合子频率(0.2228)和Tfc_2基因频率(0.4019)显著高于对照组(分别为0.1436,p<0.05和0.2970,p<0.01),胃癌组和对照组的α_1-抗胰蛋白酶亚型分布无显著差异。用薄层聚丙烯酰胺等电聚焦结合免疫固定分析了上海地区200例汉族胃癌病人和200例正常对照组的组特异性成分(Gc)亚型分布,发现胃癌组Go1F表型频率(0.22)和Gc1F基因频率(0.4375)均显著高于正常对照组(分别为0.14和0.3600,均为p<0.05)。

寄生于黄牛与水牛的肉孢子虫同工酶研究

目的比较几种肉孢子虫过氧化物酶、磷酸葡萄糖异构酶同工酶酶谱。方法将肉孢子虫包囊从黄牛和水牛肉中剖离,经超声粉碎、高速离心后取上清,聚丙烯酰胺垂直平板梯度凝胶电泳染色进行同工酶酶谱分析。结果黄牛和水牛的枯氏肉孢子虫两种酶酶带相似,其中过氧化物酶都出现7条带,位于pH6.98～4.41之间,磷酸葡萄糖异构酶出现6条带,pH位于6.53～4.66之间;黄牛和水牛的毛状肉孢子虫的两种酶酶带相似,其中过氧化物酶都出现5条带,pH位于7.15～4.97之间,磷酸葡萄糖异构酶出现4条带,pH位于6.51～4.70之间。枯氏肉孢子虫、毛状肉孢子虫、梭状肉孢子虫在同工酶酶谱上存在明显的差异,酶带数目、酶带的pH值分布均不同。结论同工酶谱分析证明黄牛和水牛都是枯氏肉孢子虫、毛状肉孢子虫自然中间宿主。枯氏肉孢子虫、毛状肉孢子、梭状肉孢子虫为不同的虫种。

水稻根尖质膜蛋白质组学研究方法的建立

以徐稻3号水稻苗期幼嫩根尖为材料，利用葡聚糖／聚乙二醇两相分配法纯化得到纯度达90％的质膜组分，使用优化的双向电泳水化液溶解质膜蛋白，通过等电聚焦／十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（IEF／SDS-PAGE）分离和基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱（MAI-DI—TOF／TOF）分析，鉴定了31个水稻质膜相关蛋白。结果表明IEF／SDSPAGE双向电泳适合分离亲水性相对较高的膜附着蛋白。进一步利用高盐和温和去污剂对纯化的质膜进行洗涤，以降低质膜组分的复杂程度，通过SDS-PAGE单向电泳分离和液相色谱串联质谱（LC-MS／MS）分析，鉴定了8个质膜蛋白。经洗涤后的质膜组分复杂度显著降低，SDS-PAGE中的蛋白条带只包含1～2种蛋白，且主要为疏水性较强的穿膜蛋白，说明多种生物化学分离方法及不同质谱分析的综合运用，是解决生物膜蛋白质组学难点的有效途径。

大豆DNA导入水稻引起后代种子贮藏蛋白变异

以大豆为外源DNA供体，用浸种及幼苗浇灌法和花粉管通道法直接将大豆总DNA导人受体水稻，经常规栽培获得水稻后代种子。采用薄层等电聚焦电泳和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳法，分析了经大豆总DNA处理得到的水稻后代种子中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。结果显示，大豆DNA可能引起水稻种子贮藏蛋白的变异。变异现象主要表现在两个方面；一是总条带数不变，但部分条带的迁移年与对照相比出现差异；再则就是出现了球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白条带增加的现象。

一种检测血清β脂蛋白谱的新方法

目的建立一种分离血清β脂蛋白(βLp)亚组分的新方法———二阶双梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(s-DGPAGE)法。方法在不同浓度梯度凝胶中匹配一定的pH梯度,借助浓度梯度的分子筛作用和pH梯度的聚焦作用,促进βLp亚组分分离,通过凝胶成像系统和光密度扫描仪完成βLp谱的记录和量化分析。血清βLp的分离采用一阶DGPAGE。结果s-DGPAGE法能将血清βLp分离出4种亚组分,分别命名为βLp1、βLp2、βLp3和βLp4,并可量化出各亚组分在βLp和血清脂蛋白整体中的相对含量。结论s-DGPAGE法能检出血清βLp的不均一组成,反映机体血清βLp的动态平衡状态,是一种简便实用的新方法。

抗EGF单克隆抗体表面电荷不均一性的分析

优化了离子交换色谱法分析抗表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)单克隆抗体表面电荷不均一性的条件,分析糖基化对单克隆抗体表面电荷不均一性分布的影响。应用凝胶等电聚焦电泳方法测定单克隆抗体电荷不均一性组分等电点分布范围,再优化离子交换色谱法分析抗EGF单克隆抗体表面电荷不均一的条件,包括色谱柱、流动相pH、梯度及柱温,选择最佳的分析条件分析糖基化对单克隆抗体的电荷不均一性分布的影响。凝胶等电聚焦电泳方法分析抗EGF单克隆抗体电荷不均一性组分等电点分布范围在8.0～8.6范围内,离子交换色谱法分析表面电荷不均一性的最佳条件:TSK-gel CM-STAT离子交换色谱柱、流动相pH 6.0、合适的起始梯度及梯度陡度有利于电荷不均一性各组分的分离,柱温为40℃;去除糖基化的单克隆抗体分布在酸性区的表面电荷不均一组分相对含量增加。合适的分析条件能够使单克隆抗体表面电荷不均一性各组分在离子交换色谱柱上得到最佳分离及获得较高灵敏度,单克隆抗体的糖基化修饰使表面电荷不均一性向碱性区发生偏移。

高效毛细管电泳技术

介绍了新型分离分析技术高效毛细管电泳的进展，包括基本理论、仪器工作原理、进样方法及各种分离模式，并讨论了这一新技术的特点以及在药物分析方面的应用与前景。

有关植物双向电泳体系建立中几个问题的探讨

双向电泳技术是目前最常用的能够从植物组织中分离出上千种蛋白的技术．因此，需对蛋白样品制备过程、等电聚焦、第二相电泳、染色等进行分析探讨，结果表明，样品制备需根据样品的成分选择不同的裂解液成分（如：CHAPS，TritonX-100和DTT等）；胶条越长要求上样量越大（考染上样量约为银染上样的5倍），等电聚焦电压越大，聚焦过程也越长；SDS-PAGE胶体积分数为10％～15％，常用12％；第二相电泳需选择恒定电流，且先以10mA／胶，跑0．5～1．0h，再以大电流30mA／胶至第二相电泳完成．

毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用

单克隆抗体药物在生物制药行业占有重要地位,是生物医药领域发展的主要方向。因此,单克隆抗体药物的质量控制已成为全球生物制药企业及法规机构关注的热点,对单克隆抗体药物精确表征的需求日益增加。毛细管电泳技术具有分离效率高、分析速度快、分离模式多、样品用量少等特点,已成为单克隆抗体药物分析和质量控制的重要手段。该文对毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管区带电泳等模式在单克隆抗体药物的纯度分析、等电点测定、电荷异质性分析和N-寡糖分析的应用进行综述,以期为国内单克隆抗体研究开发和生产的企事业单位提供技术参考。

海生红藻多管藻中2种R-藻红蛋白的分离与分析

本研究以海生红藻多管藻(Polysiphoniaurceolata)为材料,用DEAESepharoseFastFlow离子交换层析和ButylSepharose4FastFlow疏水作用层析,从SephacryS-300(S-300)凝胶过滤所得R-藻红蛋白中分离纯化出在带电性和疏水性表现结构特性差异的2种R-藻红蛋白组分,R-PEI和R-PEII。这2种R-藻红蛋白在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和非变性等电聚焦(nativeisoelectricfocusing,Native-IEF)中均表现单一条带,等电点(pI)分别为R-PEI4.7,R-PEII4.6。R-PEI和R-PEII有着相同的荧光光谱和400~750nm吸收光谱,仅在波长小于400nm时R-PEI表现出大于R-PEII的紫外光吸收。SDS-PAGE多肽组成分析结果证明,R-PEI和R-PEII不仅有相同的α、β、γ等有色亚基,而且含有相同无色多肽。这些结果表明,R-PEI和R-PEII来自于多肽链的结构特性变化,没有对R-藻红蛋白各亚基的发色团构象及其微环境产生明显影响。

响应面法优化川芎蛋白提取工艺及抗氧化活性研究

为优化川芎蛋白(Ligusticum chuanxiong protein,LCP)的提取工艺,并考察其抗氧化活性。基于单因素实验,采用Box-Behnken响应面法,以料液比、提取时间、提取溶剂pH为考察因素,LCP得率为指标,优化LCP提取工艺;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定LCP的分子量范围;测定LCP的等电点(pI)及溶解度,并考察LCP的抗氧化活性。结果表明:最佳提取条件为料液比1:15(g/mL)、提取时间1.5 h、pH6,在优化条件下LCP得率为(2.36%±0.13%),实测值与理论值较为接近,表明该数学模型可用于优化LCP提取工艺。最优条件下提取的LCP分子量在17~48 kDa,等电点为3.88,pH8时溶解度为96%,羟自由基清除能力IC_(50)为1.18 mg/mL、超氧阴离子自由基清除能力IC_(50)为0.57 mg/mL、1,1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH)自由基清除能力IC_(50)为1.31 mg/mL。该法提取的LCP具有较好的抗氧化活性,可为LCP抗氧化活性的进一步研发提供实验思路。

膜蛋白双向电泳技术在软骨细胞相关研究中的应用

目的探索应用双向电泳技术研究人类关节软骨细胞膜蛋白蛋白组学的可行性及膜蛋白双向电泳与总蛋白电泳技术的互补性。方法取材膝关节软骨组织,应用II型胶原酶/透明质酸酶DMEM溶液消化法分离软骨细胞,分别提取总蛋白和膜蛋白,进行双向电泳研究,观察膜蛋白所生成2-DE电泳凝胶的图像质量,并对比膜蛋白与总蛋白双向电泳凝胶图像之间蛋白点分布的差异和互补性。结果膜蛋白双向电泳可获得较高质量的电泳图像,每张胶图可识别412.3±13.5个蛋白点,蛋白点主要分布在等电点PH5.0-9.0的偏碱性区域。总蛋白双向电泳凝胶可识别564.3±5.9个蛋白点,蛋白点主要分布在等电点PH3.0-7.0的偏酸性区域。结论软骨细胞膜蛋白双向电泳可产生高质量的凝胶图像,其分离蛋白质的等电点分布区域与总蛋白双向电泳技术形成互补,可为软骨细胞为样本的相关疾病病因学研究提供更多的信息。

蛇毒血凝酶纯度分析方法研究

目的:建立蛇毒血凝酶纯度测定方法。方法:分别采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和等电聚焦法(IEF),对凝胶考染并扫描;采用体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC),使用TSK G3000SW(7.8 mm×300 mm)凝胶柱,流动相为55 mmol.L-1柠檬酸钠-0.01%Tween 80溶液;流速0.5 mL.min-1,检测波长280 nm;采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),使用C8Vydac(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为0.1%三氟乙酸溶液(A)-含0.1%三氟乙酸的90%乙腈(B),梯度洗脱,流速0.8 mL.min-1,;柱温为45℃,检测波长:280 nm。结果:4种方法测得蛇毒血凝酶的纯度分别为89.3%,88.5%,95.4%,87.4%。结论:对于蛇毒血凝酶纯度测定,非还原SDS-PAGE、IEF及RP-HPLC法均可准确地反映其样品纯度。

羊乳酪蛋白的乳化性质和热稳定性研究

试验采用等电点沉淀法和高速离心法提取崂山奶山羊原料乳的酪蛋白,并对其等电点、SDS-PAGE图谱、乳化活力、乳化稳定性、浊度和热稳定性进行分析。结果表明:崂山奶山羊乳酪蛋白的等电点pH为4.10,分子量为20~40 kDa,包括α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋,且β-酪蛋白含量最多。两种提取方法所得酪蛋白溶液的乳化性质和浊度具有极显著性差异(p<0.01);酪蛋白的热稳定性随温度的升高而降低。相比于高速离心法,等电点沉淀法制备的酪蛋白电泳图谱条带清晰、纯度较高、热稳定性较好,且酪蛋白溶液的乳化性均一性好。

毛细管电泳专利技术概述

本文通过国家专利检索与服务系统检索近50年的毛细管电泳技术相关专利,从专利分析的角度,揭示全球毛细管电泳技术创新的发展态势、技术布局、技术发展动向以及核心专利等,希望能够为我国毛细管电泳技术的发展与创新提供技术支撑。