甲基丙烯酰明胶水凝胶作为细胞三维培养支架在骨组织工程中的应用

背景:骨缺损的治疗一直是临床医生亟待解决的临床难题,用甲基丙烯酰明胶进行细胞体外3D培养,可以为大面积骨缺损的治疗提供新的方向。目的:文章综述了甲基丙烯酰明胶作为3D细胞培养支架在骨组织工程中的研究进展,以期为临床骨缺损修复提供进一步的参考。方法:应用计算机检索中国知网及PubMed数据库1986年1月至2023年8月收录的文献,中英文检索词分别为“骨缺损,骨组织工程,生物支架材料,水凝胶,光交联水凝胶,甲基丙烯酰明胶,三维培养,细胞培养”和“Bone defect,Bone tissue engineering,Biomaterial scaffold,Hydrogel,Methylacrylyl photocrosslinked hydrogel,Three-dimensional culture;Cell culture”,最终纳入68篇文献进行综述分析。结果与结论:①同二维培养相比,3D培养可以在无菌条件下,构建立体三维空间,更好地模拟体内环境,为细胞提供合适的温度、酸碱度及足够的营养,使细胞能够在体外正常生长增殖并保持其正常结构与功能,具有独特优势。②在骨组织工程生物支架材料的选择中,水凝胶因其良好的生物相容性、可降解性及具有立体三维网络结构等优点,已被广泛应用于骨再生的研究。③甲基丙烯酰明胶的物理及生物性能受到浓度、光照时间及光引发剂种类以及反应体系等因素的影响,而这些性能均能对细胞的黏附、生长及增殖,甚至细胞形态及功能产生一定的影响。④甲基丙烯酰明胶因具有良好的生物相容性、物理可调节性、可注射性及光敏性能,已被广泛应用于3D细胞封装、3D生物打印及基于数字光处理的立体光刻技术等细胞3D培养体系中。⑤应用各类复合甲基丙烯酰明胶进行细胞的3D培养,可以更好地促进血管形成及骨再生,为临床骨缺损的治疗提供更多可能。⑥目前甲基丙烯酰明胶的来源、合成的方法以及安全性尚没有健全的标准,需要进一步加强研究,对甲基丙烯酰明胶在3D细胞培养领域的应用进行更深入的完善。

甲基丙烯化明胶微球缓释Kartogenin修复髓核退变的体外评估

背景:细胞外基质合成与降解的失衡是髓核退变的主要原因,小分子药物Kartogenin(KGN)可恢复基质合成和降解的平衡。利用合适的载药系统实现KGN的缓释对KGN发挥长期有效的治疗至关重要。目的:用甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)包裹KGN,通过微流控技术制备成可注射的水凝胶微球,探究其生物相容性和对髓核细胞生物学功能的影响。方法:将β-环糊精(β-cyclodextrins,β-CD)与KGN混合成包合物,与10%GelMA按1∶9的体积混合,利用微流控技术制备可注射水凝胶微球GelMA@β-CD@KGN,扫描电镜表征微球的微观形貌,检测水凝胶微球浸泡于PBS中1个月的药物释放情况。提取SD大鼠髓核细胞,将第1代细胞分3组培养:对照组单独培养髓核细胞,另外两组分别将GelMA@β-CD微球、GelMA@β-CD@KGN微球与髓核细胞共培养,利用CCK-8法检测细胞增殖,活死细胞染色检测细胞存活。分别用含有白细胞介素1β和不含白细胞介素1β的完全培养基将髓核细胞与两种微球共培养,采用RT-PCR法检测髓核细胞基质合成蛋白和分解蛋白的mRNA表达。结果与结论:①扫描电镜下可见,冻干后的GelMA@β-CD@KGN微球为规则的球形,保持高度分散且大小均一,形状饱满;GelMA@β-CD@KGN微球体外可持续释放药物,至30 d时药物释放量达到总量的62%;②活死细胞染色显示,GelMA@β-CD@KGN可保持髓核细胞的活性;CCK-8检测显示,GelMA@β-CD@KGN可促进髓核细胞的增殖;③在含或不含白细胞介素1β的完全培养基中,GelMA@β-CD@KGN微球组聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的mRNA表达均高于GelMA@β-CD微球组(P<0.05,P<0.01),基质金属蛋白酶13、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5的mRNA表达均低于GelMA@β-CD微球组(P<0.01);④结果表明,GelMA@β-CD@KGN微球具有良好的生物相容性和药物缓释能力,作为载药系统是一种具有广阔应用前景的生物材料。

负载丹酚酸B甲基丙烯酰化明胶水凝胶对椎间盘退变的作用

背景:丹酚酸B可抑制H2O2诱导的细胞损伤,有效清除过量的活性氧,发挥抗氧化特性,已被应用于许多疾病的治疗研究中。但是,有关丹酚酸B在椎间盘退变中作用及其作用机制的研究相对较少。目的:以甲基丙烯酰化明胶水凝胶为载体,通过体外细胞实验与动物体内实验观察丹酚酸B对氧化应激诱导的椎间盘退变的作用以及作用机制。方法:制备负载丹酚酸B的甲基丙烯酰化明胶水凝胶(载药水凝胶)。①体外细胞实验:分离提取成年SD大鼠腰椎髓核细胞,选择第3代髓核细胞,分组处理:A组加入完全培养基;B组加入含H2O2的完全培养基;C组接种于未载药水凝胶上,加入含H2O2的完全培养基;D组接种于载药水凝胶上,加入含H2O2的完全培养基;E组接种于载药水凝胶上,加入含H2O2与TLR4信号通路抑制剂的完全培养基,检测细胞增殖、氧化应激、炎症反应、细胞基质相关蛋白的基因表达以及TLR4/核因子kB信号通路蛋白表达。②动物体内实验:将60只成年SD大鼠随机分为正常组、针刺组、针刺+丹酚酸组、针刺+水凝胶组、针刺+载药水凝胶组,每组12只,后4组采用针刺建立椎间盘退变模型后依次注射生理盐水、丹酚酸B溶液、未载药水凝胶、载药水凝胶治疗,术后4周分别进行影像学检测、病理组织形态观察。结果与结论:①体外细胞实验:与A组比较,B组细胞增殖下降,氧化应激反应及炎症反应增强,细胞外基质降解酶(基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13、ADAMTS4、ADAMTS5)的表达增加(P<0.05),细胞外基质(Ⅱ型胶原、蛋白聚糖)的合成减少(P<0.05),TLR4/核因子kB信号通路蛋白表达增加(P<0.05);与B组比较,D、E组细胞增殖升高,氧化应激反应及炎症反应减弱,细胞外基质降解酶的表达减少(P<0.05),细胞外基质的合成增加(P<0.05),TLR4/核因子kB信号通路蛋白表达减少(P<0.05),其中以E组效果更显著。②动物体内实验:术后4周,针刺+载药水凝胶组退变椎间盘的椎间盘高度指数、MRI指数以及椎间盘病理组织学评分均较针刺组有了显著改善,而单纯注射水凝胶或是丹酚酸B溶液虽也可一定程度地改善椎间盘退变情况,但均不及注射载药水凝胶组。③结果表明,负载丹酚酸B的甲基丙烯酰化明胶水凝胶可抑制退变椎间盘组织中的氧化应激反应与炎症反应,抑制细胞外基质的降解,缓解椎间盘退变的进程,该作用可能通过抑制TLR4/核因子kB信号通路来完成的。

纳米复合甲基丙烯酰明胶水凝胶在不同骨缺损环境中应用的价值

背景:近年来,纳米复合甲基丙烯酰明胶水凝胶在修复骨组织损伤方面的研究备受关注。目的:综述应用于骨组织工程的纳米复合甲基丙烯酰明胶水凝胶近年来的最新进展,举例说明纳米复合甲基丙烯酰明胶水凝胶在不同骨缺损环境中的应用。方法:应用计算机检索中国知网、万方、PubMed和Web of Science数据库2016-2023年发表的相关文献,中文检索词为:“明胶,甲基丙烯,纳米,骨,骨组织工程,骨再生,成骨”,英文检索关键词为“gelatin,methacryl*,nano*,bone,bone tissue engineering,bone regeneration,osteogenesis”。结果与结论:①当前作为甲基丙烯酰明胶填料的纳米材料包括无机纳米材料、有机纳米材料以及有机-无机纳米杂化材料。②无机纳米材料可有效提高水凝胶的力学强度、触变性能,调节其降解时间,同时还可通过调节自身表面电荷、搭载药物/因子、自身降解释放金属离子等方式,实现水凝胶的抗菌、促骨形成、免疫调节、促血管生成等功能。③有机纳米材料、有机-无机纳米杂化材料复合甲基丙烯酰明胶水凝胶是两类新兴的材料,目前研究相对较少,但从已发表的研究来看,相比无机纳米材料复合甲基丙烯酰明胶水凝胶,有机纳米材料复合甲基丙烯酰明胶水凝胶的生物相容性及载药性能更佳,纳米相与有机聚合物相间的相互作用更强,纳米粒子的分散性更好。④有机-无机纳米杂化材料复合甲基丙烯酰明胶水凝胶结合了前二者的优势,且金属离子释放可控性更佳,具有巨大的研究潜力。⑤纳米材料可增强甲基丙烯酰明胶水凝胶的抗菌、免疫调控、促成骨等生物学性能,以促进感染性骨缺损、伴糖尿病骨缺损、骨肉瘤切除术后等复杂骨缺损环境下的骨再生。然而,纳米复合甲基丙烯酰明胶水凝胶用于骨缺损修复中的研究还仅限于动物实验,仍需要进行更多的安全性评价和临床试验。

负载ZIF-8的GelMA水凝胶制备及其药物缓释性能和抑菌作用评价

目的:制备一种含沸石咪唑类骨架材料8(ZIF-8)的复合光交联水凝胶,评价其体外细胞毒性、药物释放能力和抗菌性能。方法:采用水热法合成ZIF-8颗粒,扫描电子显微镜(SEM)观察ZIF-8颗粒微观形态表现。将ZIF-8颗粒以质量分数0.2%的比例与甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)混合获得复合水凝胶GelMA-Z。采用原子吸收光谱法检测各时间点GelMA-Z中锌离子(Zn^(2+))累计释放量。NIH-3T3细胞分为对照组、GelMA组和GelMA-Z组,将GelMA和GelMA-Z与NIH-3T3细胞共培养1、3和7 d,采用CCK-8法检测各组细胞存活率。大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)分为对照组、GelMA组和GelMA-Z组,将GelMA和GelMA-Z分别与E.coli和S.aureus共培养6、12和24 h,采用酶标仪检测不同时间点各组细菌活性,采用平板抑菌实验和活/死细菌染色实验检测各组细菌菌落形成情况和活/死细菌染色情况。结果:SEM观察,采用水热法合成的ZIF-8颗粒具有均匀的粒径。原子吸收光谱法检测,GelMA-Z中Zn^(2+)在1 d内呈突释阶段后缓慢释放,7 d左右达到平衡。与对照组比较,1、3和7 d时GelMA组和GelMA-Z组细胞存活率均大于90%,差异无统计学意义(P>0.05)。酶标仪检测菌液活性,与细菌共培养6、12和24 h时,与对照组和GelMA组比较,GelMA-Z组E.coli和S.aureus活性明显降低(P<0.05)。平板抑菌实验,GelMA-Z组中菌液涂布后形成的菌落数明显少于对照组和GelMA组。活/死细菌染色实验,GelMA-Z组存在大量红色荧光染色的死细菌,对照组和GelMA组中则为大量绿色荧光染色的活细菌。结论:负载ZIF-8的GelMA水凝胶可实现原位光交联,具有良好的Zn^(2+)释放能力和抗菌性,是一种可用于感染伤口治疗的新型水凝胶敷料。

光交联复合水凝胶支架中人牙髓干细胞的成骨/成牙分化能力

背景:甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl,Gel-MA)与经处理牙本质基质(treated dentin matrix,TDM)在一定比例下经过紫外线交联后形成的复合水凝胶支架具有良好的孔隙率、机械性能、溶胀性能及生物降解率,这为临床上年轻恒牙的牙髓再生提供了新的思路和方法。目的:探究1∶2质量比Gel-MA/TDM复合光交联水凝胶支架对人牙髓干细胞增殖能力及成骨/成牙本质分化能力的影响。方法:将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中,采用CCK-8实验检测人牙髓干细胞在复合水凝胶支架中的增殖能力。将第3代牙髓干细胞接种至1∶2质量比Gel-MA/TDM复合水凝胶支架中并进行成骨诱导,采用碱性磷酸酶染色及茜素红染色观察矿化结节的形成情况,采用RT-PCR检测成牙相关因子(牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白)和成骨相关因子(骨钙素、Runt相关转录因子2)的基因表达。结果与结论:①CCK-8检测结果显示,前7 d的牙髓干细胞增殖能力明显升高,第10天时速度减缓;②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性及矿化结节生成强于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05);③RT-PCR结果显示,Gel-MA/TDM复合水凝胶组牙髓干细胞中牙本质基质蛋白1、牙本质涎磷蛋白、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因表达量明显高于单纯Gel-MA水凝胶组(P<0.05),且14 d基因表达量明显高于7 d(P<0.05)。结果表明,培养在1∶2 Gel-MA/TDM复合水凝胶支架上的牙髓干细胞表现出较好的增殖能力,能够强化牙髓干细胞的成骨、成牙本质分化能力。

聚丙烯酰胺改良甲基丙烯酰化明胶接枝钛合金支架的促成骨性能

背景:钛及其合金因出色的生物相容性、耐腐蚀性、力学性能被广泛应用于骨科内植物中,但其本身拥有生物惰性不能为成骨细胞提供良好的生长环境,较难形成良好的骨整合。目的:在钛合金支架表面构建甲基丙烯酰化明胶和聚丙烯酰胺复合水凝胶材料,分析其体外促成骨能力。方法:将甲基丙烯酰化明胶与丙烯酰胺混合,加入交联剂与催化剂合成甲基丙烯酰化明胶-聚丙烯酰胺(Gelma-PAAM)水凝胶。将经亲和硅烷表面改性后的钛合金支架分别与甲基丙烯酰化明胶(Gelma)水凝胶、Gelma-PAAM水凝胶混合,完成负载(分别记为Ti-Gelma、Ti-Gelma-PAAM),比较支架表面两种水凝胶的溶胀比、降解率,通过扫描电镜观察水凝胶与钛合金的结合状态。将大鼠骨髓间充质干细胞分别接种于单纯钛合金支架、Ti-Gelma支架、Ti-Gelma-PAAM支架中,检测细胞增殖、黏附及成骨分化能力。结果与结论:①与Gelma水凝胶相比,Gelma-PAAM复合水凝胶具有更高的溶胀比与更低的降解率;②扫描电镜下可见两种水凝胶表面为蜂窝状结构,与多孔钛合金支架结合后呈膜样包裹于支架表面并充斥孔隙,其中Gelma-PAAM复合水凝胶包裹支架得更充分;③CCK-8检测与活-死荧光染色显示,与Ti-Gelma、Ti-Gelma-PAAM支架共培养后的骨髓间充质干细胞增殖良好并保持较高的活性;成骨诱导培养后,单纯钛合金支架组细胞碱性磷酸酶活性、钙沉积量与成骨基因表达量最低,Ti-Gelma-PAAM组细胞碱性磷酸酶活性、钙沉积量与成骨基因表达量最高;④鬼笔环肽骨架染色显示,单纯钛合金支架组、Ti-Gelma组细胞稀疏、伸展不够充分,Ti-Gelma-PAAM组细胞伸展充分、肌动蛋白丝致密;⑤结果表明,Gelma-PAAM水凝胶具有良好的生物相容性与促成骨能力,较Gelma水凝胶更适宜用于钛合金金属表面的促成骨改性。

富血小板纤维蛋白复合甲基丙烯酰化明胶水凝胶的促成骨性能

背景:富血小板纤维蛋白具有制备简单、制作费用低、安全性高等诸多优势,目前已被广泛应用于口腔颌面外科骨缺损修复研究中,但存在降解速度太快、生长因子释放时间短等问题。目的:将富血小板纤维蛋白负载于甲基丙烯酰化明胶水凝胶内,通过体内外实验分析其促成骨性能。方法:①抽取新西兰大白兔静脉血,制备富血小板纤维蛋白。分别制备含0,0.05,0.075,0.1 g富血小板纤维蛋白的甲基丙烯酰化明胶水凝胶,分别记为GelMA、GelMA/PRF-0.05、GelMA/PRF-0.075、GelMA/PRF-0.1,表征水凝胶的微观形貌与体外缓释性能。②将4种水凝胶分别与MC3T3-E1细胞共培养,以单独培养的细胞为对照,检测细胞增殖活性;成骨诱导后,检测细胞碱性磷酸酶活性、矿化能力、成骨相关基因(骨钙素、骨桥蛋白、RUNX2)mRNA与蛋白表达,ERK1/2-p38 MAPK通路蛋白mRNA与蛋白表达。③取15只新西兰大白兔。在每只兔颅骨部分别制备4个直径8 mm的全层骨缺损,其中1处缺损不植入任何材料(空白对照组),另3处缺损分别植入GelMA水凝胶、富血小板纤维蛋白、GelMA/PRF-0.1水凝胶。术后4,8,12周,进行骨缺损部位Micro-CT扫描与骨组织形态观察。结果与结论:①扫描电镜下可见4组水凝胶都具有蜂窝状的孔隙结构,并且随着水凝胶中富血小板纤维蛋白含量的增加,水凝胶的孔径轻微减小,但组间比较无明显差异;3组GelMA/PRF水凝胶均能以一定的速率释放转化生长因子β1与胰岛素样生长因子1,随着时间的延长,转化生长因子β1与胰岛素样生长因子1累计释放量显著增加。②CCK-8检测与活/死染色显示,3组GelMA/PRF水凝胶可促进MC3T3-E1细胞的增殖;碱性磷酸酶染色、茜素红染色及成骨基因检测结果显示,GelMA/PRF水凝胶可促进MC3T3-E1细胞的成骨分化,同时可抑制ERK1/2-p38 MAPK通路蛋白的表达,并且呈现富血小板纤维蛋白含量依赖性。③Micro-CT扫描显示,GelMA/PRF-0.1水凝胶组大鼠骨缺损处骨矿物质密度与骨体积分数均高于其他3组(P<0.05);苏木精-伊红染色显示,相较于其他3组,GelMA/PRF-0.1水凝胶组大鼠骨缺损处新骨形成更快、更成熟。④结果表明,GelMA/PRF水凝胶在体内外均具有良好的促成骨性能,该作用可能与抑制ERK1/2-p38 MAPK通路蛋白表达有关。

负载姜黄素可注射微球延缓椎间盘的退变

背景:椎间盘退变机制复杂,炎症通路激活、炎症因子泛滥、活性氧过度积累等均可加速椎间盘退变进程。姜黄素是从中药材姜黄中提取的天然药物,具有抑制炎症、抗氧化应激等药理作用。目的:探讨负载姜黄素的缓释微球局部注射延缓大鼠椎间盘退变的疗效。方法:①采用微流控技术制备负载姜黄素的甲基丙烯酸酰化明胶缓释微球,评估其体外释药和降解情况;②将缓释微球与未载药微球分别与髓核细胞共培养,以单独培养的细胞为对照,将3组细胞分别培养于正常环境和氧化应激环境(加入H_(2)O_(2))中,通过CCK-8、活/死染色实验评估细胞的活性与增殖情况,qRT-PCR实验检测相关因子的表达水平;③将30只SD大鼠随机分为正常组、退变组、未载药微球组、姜黄素组、缓释微球组,每组6只,在大鼠尾椎7-8和8-9节段经皮穿刺建立椎间盘退变模型,未载药微球组、姜黄素组、缓释微球组退变的椎间盘内注射对应的溶液。4周后,通过影像学与组织学观察椎间盘组织结构改变。结果与结论:①缓释微球可缓慢持续释放姜黄素,至28 d时释放姜黄素总量为(84.11±2.71)%;在含有胶原酶的PBS中,缓释微球质量逐渐减小,至第5周时消失。②CCK-8和活/死染色实验显示,在正常环境下,缓释微球不会影响髓核细胞的增殖活力;在氧化应激环境下,相比未载药微球,缓释微球可维持髓核细胞的增殖活力。qRT-PCR实验显示,相较于正常环境,氧化应激环境激活了髓核细胞中多种炎症因子mRNA的过量表达;在氧化应激环境下,相较于未载药微球组与对照组,缓释微球组肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6及基质金属蛋白酶3的mRNA表达降低,Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA表达升高。③动物体内实验结果显示,未载药微球组4周后的影像学与组织学评估与退变组比较无明显差异;姜黄素组的椎间隙高度及MRI评分在第1周时较退变组和未载药微球组虽有一定程度改善,但在第4周时其影像学与组织学评估均不如缓释微球组。④结果表明,姜黄素缓释微球能够抑制H_(2)O_(2)诱导的髓核细胞凋亡、延缓椎间盘退变进程,其机制与抑制核因子κB通路、降低氧化应激水平有关。

力学刺激提高生物3D打印软骨构建物基质的形成

背景:基质分泌不均匀、力学强度不足是影响组织工程构建物在体内形成效果的重要因素,力学刺激是促进细胞外基质分泌的有效手段。目的:探索3D生物打印复合支架在力学加压环境下的生物学表现。方法:采用3D生物打印技术制备软骨细胞-甲基丙烯酰胺基明胶复合支架,活死染色观察细胞存活情况。将复合支架置于力学加压生物反应器中进行加压培养,以6孔板中不加压培养的复合支架为对照,活死染色观察细胞存活情况,组织学染色观察复合支架体外软骨形成情况,qRT-PCR检测成软骨相关基因mRNA的相对表达量。将加压与不加压复合支架分别植入裸鼠皮下,5周后取材,组织学观察软骨形成情况。结果与结论:①复合支架外观呈现清晰的网格状结构,体外培养1,4,7 d时,支架形态稳定、结构清晰,细胞存活率均在90%以上;②培养2周后,加压组复合支架中的细胞存活率低于不加压组(P<0.05);苏木精-伊红染色显示两组复合支架均有明显的软骨陷窝结构,细胞在材料中分布较均匀,加压组复合支架的材料间空隙内有更多新生软骨组织形成;番红O染色显示两组均可见红色软骨基质形成,加压组细胞周基质染色更深;Ⅰ型胶原免疫组织化学染色显示,加压组着色更为明显;加压组弹性蛋白、Ⅱ型胶原的mRNA表达高于不加压组(P<0.05);③植入裸鼠皮下5周后,苏木精-伊红染色显示加压组软骨组织形成更为均一,软骨细胞大小均匀,陷窝结构明显;④结果表明,虽然体外加压刺激会引发3D生物打印软骨细胞-甲基丙烯酰胺基明胶复合支架中的细胞死亡,但同时会促进存活细胞向支架空隙间长入,提高其软骨基质相关基因的表达,促进成软骨能力。

可评价注射式再生支架修复效果的小鼠骨缺损模型的构建研究

目的建立小鼠股骨缺损模型并探索甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)对缺损后骨再生的影响。方法将40只8周龄的雌性C57BL/6N小鼠随机分成4组:骨缺损组(n=10),5%GelMA组(n=10),10%GelMA组(n=10),15%GelMA组(n=10)。造模2周后,使用HE染色观察股骨组织结构;使用Masson染色观察股骨胶原纤维形态;使用OCN免疫组化染色分析骨特异性蛋白表达水平。结果GelMA具有良好的可注射性,可经PCR Pipettes移液器注入骨缺损区。HE染色结果表明10%GelMA组相较于骨缺损组、5%GelMA组和15%GelMA组具有更好的骨修复效果,缺损部位组织结构更加完整;Masson染色结果表明10%GelMA组有更多成骨相关的胶原纤维形成;RT-qPCR分析显示,10%GelMA组小鼠骨缺损部位OCN表达显著高于骨缺损组(P<0.001)、5%GelMA组(P<0.01)和15%GelMA组(P<0.01)。10%GelMA组小鼠骨缺损部位Osterix表达显著高于骨缺损组(P<0.001)、5%GelMA组(P<0.001)和15%GelMA组(P<0.01);OCN免疫组化染色结果表明10%GelMA组的修复区骨特异性蛋白表达显著高于骨缺损组(P<0.01)、5%GelMA组(P<0.01)和15%GelMA组(P<0.05)。结论构建了可评价注射式再生支架修复效果的小鼠骨缺损模型,并应用于基于GelMA的可注射再生支架筛选和治疗效果评价,为开展相关领域工作提供实验基础。

甲基丙烯酰化明胶3D培养的CAR-T细胞靶向杀伤脑胶质瘤细胞的研究

目的研究在甲基丙烯酰化明胶中培养的CAR-T细胞功能及活性的变化,以及用GelMA为载体,负载缓释CAR-T细胞的可行性。方法基因编辑靶向表皮生长因子受体(EGFR)的第二代CAR-T细胞,制备负载CAR-T的甲基丙烯酸酯明胶,通过水凝胶成胶过程图像、储存及损耗模量验证水凝胶成功制备;使用荧光显微镜荧光成像、流式细胞分析验证CAR-T的成功转染;应用CCK-8实验检测水凝胶的生物相容性;构建共培养模型,利用Elisa试剂盒、细胞毒性LDH试剂盒检测上清液中释放的细胞因子、LDH,检测CAR-T是否成功活化,评估CAR-T细胞杀伤效应。结果荧光显微镜下观察转染第4天的CAR-T细胞,见CAR-T细胞聚集成团并散发绿色荧光;第9天流式细胞术示CD3+T细胞的慢病毒转染率为42.2%,CD8+T细胞:CD4+T细胞约为1∶1,CAR-T细胞成功制备。CCK8实验示水凝胶无毒性。Elisa试剂盒示上清液中细胞活性因子IFN-γ释放量显著增多,提示CAR-T细胞识别EGFR抗体后,可成功活化。当效靶比为1∶1时,U87细胞毒性为71.75%,而U87 EGFRvⅢ细胞毒性为18.13%。结论甲基丙烯酸酯化明胶负载培养的CAR-T细胞活性良好,功能正常,可设计使用该水凝胶负载递送CAR-T细胞,实现CAR-T细胞的精确靶向治疗。

复合软骨修复材料支架的构建

目的:构建一种脱细胞软骨/GelMA复合材料支架用于修复软骨缺损。方法:对α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除(GTKO)猪肋软骨脱细胞处理,得到低免疫原性脱细胞软骨基质,进行4,6-脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色、DNA含量检测评估脱细胞效果,苏木素-伊红(HE)染色、Masson三色染色分别评估细胞外基质结构及蛋白保留情况。再将脱细胞软骨冷冻研磨成粉末状,选取聚合物甲基丙烯酰化明胶(GelMA)溶液与脱细胞软骨粉末按不同比例均匀混合,制备一种可注射型生物材料,经紫外交联后获得可生物降解的复合支架,通过溶胀性能、储能模量检测对支架进行表征,并观察支架上细胞增殖情况。结果:天然软骨DNA含量为161.2ng/mg,脱细胞软骨DNA含量仅为15.27ng/mg,该种脱细胞方法效果良好。HE染色显示细胞外基质结构完整,Masson三色染色显示脱细胞组织保留了大部分细胞外基质成分。与纯GelMA相比,脱细胞软骨/GelMA复合支架溶胀率低,力学强度稍强。骨髓间充质干细胞能在支架上黏附并增殖。结论:通过可注射型脱细胞软骨/GelMA复合材料制备的支架具有低免疫原性,适宜的储能模量,良好的生物相容性,适用于软骨修复。

基于增材制造技术的GelMA/HA水凝胶支架的制备及其研究

目的利用增材制造技术制备甲基丙烯酸酯化明胶/羟基磷灰石(GelMA/HA)复合水凝胶支架,通过微观结构表征和生物相容性测试,探究其作为骨组织工程修复支架的可行性。方法将GelMA溶液和HA颗粒混合形成均匀的生物墨水,利用增材制造技术制备GelMA/HA水凝胶支架。采用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)对复合支架及其成分进行表征。采用万能力学实验机测试样品抗压缩性能。利用CCK-8法和活/死细胞染色检测支架的细胞相容性。通过碱性磷酸酶(ALP)染色法探究其促BMSCs成骨分化的能力。结果GelMA/HA水凝胶支架内部呈清晰的多孔网格状结构,与纯GelMA支架比较,抗压性能提高。活死细胞染色实验显示,BMSCs在复合水凝胶支架上生长良好,培养7 d后细胞在支架上铺展呈梭形形态。细胞增殖实验显示,培养3、7 d的纯GelMA水凝胶支架组及GelMA/HA复合水凝胶支架组的BMSCs增殖快于空白组(P<0.05)。ALP染色实验结果表明,与空白组和纯GelMA水凝胶支架组比较,GelMA/HA复合水凝胶支架组的ALP阳性面积增加(P<0.05)。结论GelMA/HA复合水凝胶支架具有良好的生物相容性,并且对BMSCs的成骨分化具有促进作用,具备作为填充修复支架应用于骨组织工程的潜力。

负载DMOG光交联明胶水凝胶的骨组织工程研究

目的:探讨负载二甲基乙二酰甘氨酸(dimethyloxalyl glycine,DMOG)的光交联明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)水凝胶的促成骨分化作用以及对大鼠颅骨骨缺损的修复效果。方法:制备GelMA-DMOG水凝胶后,扫描电镜下观察其表面特征,体外检测其降解时间;将小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1培养于GelMA和GelMA-DMOG水凝胶表面,鬼笔环肽染色荧光观察细胞骨架形态,CCK-8法检测其细胞毒性;成骨诱导后,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色和qRTPCR检测成骨相关基因的表达,观察其对MC3T3-E1细胞成骨向分化的影响;构建大鼠颅骨骨缺损模型,4周和8周后观察GelMA和GelMA-DMOG水凝胶对骨缺损的修复效果。结果:GelMA-DMOG水凝胶孔径大小、分布及降解时间与GelMA水凝胶相比没有明显差异;两种水凝胶对MC3T3-E1细胞增殖均无明显影响;与培养在24孔板上的对照组相比,GelMA组可促进MC3T3-E1细胞成骨向分化,而GelMA-DMOG组明显增强了细胞的成骨向分化和成骨相关基因Runx2、ALP和骨钙素的表达;体内实验发现与GelMA组相比,GelMA-DMOG水凝胶处理组具有明显的促成骨成血管作用和较好的骨缺损修复效果。结论:GelMADMOG水凝胶相对于GelMA材料自身的理化性能没有改变,且体外和体内实验显示该材料对于骨缺损修复具有较好的促进作用,为骨组织工程治疗骨缺损的临床应用开辟了新途径。

基于甲基丙烯酸酯明胶的神经干细胞三维微环境的构建调控

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)移植疗法是治疗创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的一种具有潜力的解决方法。但NSCs移植后存活率低且难以定向分化为功能性的神经元,因而无法高效地促进创伤脑组织的再生。研究采用甲基丙烯酸酯明胶(gelatin methacryloyl,GelMA),通过调控GelMA的取代度和浓度,制备了具有不同力学性能的GelMA水凝胶,用于NSCs的三维包埋和培养。研究结果表明,GelMA具有良好的生物相容性,可促进NSCs的生长和分化;并且,通过对载细胞GelMA水凝胶施加拉伸载荷,可有效促进NSCs在GelMA中的定向铺展。研究结果对体外神经组织构建、三维细胞微环境调控及神经组织再生等具有参考价值。

负载尼洛替尼的甲基丙烯酰化明胶微针贴片治疗心肌梗死后心脏功能障碍的研发与应用

本研究旨在评价负载尼洛替尼的生物相容性甲基丙烯酰化明胶(GelMA)微针贴片应用于心肌梗死(简称:心梗)后对心脏功能障碍的治疗作用,为临床抗心肌纤维化治疗提供新的思路。本研究在心梗造模后10 d(疤痕成熟期),将GelMA微针贴片贴附于心外膜表面,靶向梗死及周围区递送抗纤维化药物尼洛替尼。在心梗造模后28 d,通过超声心动图、血浆脑型利钠肽、心重/体重比等指标评价心脏功能和左室重构情况;通过小麦胚芽凝集素染色评价心肌肥大情况;通过苏木精—伊红染色、天狼星红染色评价心肌纤维化情况。结果显示,相较于心梗对照组及使用空白GelMA微针贴片治疗组,负载尼洛替尼的GelMA微针贴片可减轻心肌肥大和梗死周围区纤维化过度扩张,从而预防不良心室重构,改善心功能。本研究所提这一治疗策略是纠正心梗后心脏功能障碍的一次有益尝试,有望成为纠正心梗后心脏功能障碍的新策略,对改善心梗患者的长期预后具有重要的临床意义。

载外源性TGF-β1甲基丙烯酰化明胶复合支架促进颅骨缺损修复实验研究

目的通过外源性TGF-β1加载修饰甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)水凝胶,制备可修复SD大鼠颅骨缺损的骨组织工程支架。方法首先制备含浓度为0、150、300、600、900、1200 ng/mL外源性TGF-β1的GelMA水凝胶复合支架(分别设为A、B、C、D、E、F组),运用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测培养1、4、7 d各组支架对SD大鼠BMSCs增殖活性的影响;通过ALP染色、茜素红染色、骨钙素(osteocalcin,OCN)免疫荧光染色及Western blot检测探究对BMSCs成骨分化的影响,筛选最适浓度的TGF-β1/GelMA水凝胶支架。取36只8周龄SD大鼠制备5 mm直径颅骨骨缺损模型后随机均分为3组,分别为对照组、GelMA组和GelMA+TGF-β1组(采用最适浓度TGF-β1/GelMA水凝胶支架),术后4、8周分别处死大鼠行micro-CT、HE染色和OCN免疫组织化学染色观察颅骨缺损修复效果。结果CCK-8法检测示各组TGF-β1/GelMA水凝胶支架对BMSCs增殖均有促进作用,D组作用最强,细胞活性显著高于其余各组(P<0.05)。ALP染色、茜素红染色、OCN免疫荧光染色和Western blot检测结果表明,D组BMSCs的ALP阳性面积百分比、茜素红阳性面积百分比、ALP和OCN蛋白相对表达量均显著高于其余各组(P<0.05),成骨作用最强。因此体外实验筛选出TGF-β1/GelMA水凝胶支架最适浓度为600 ng/mL。大鼠颅骨缺损修复实验micro-CT、HE染色和OCN免疫组织化学染色示,术后4、8周,TGF-β1+GelMA组新生骨质最多,新生骨组织和骨体积/组织体积比值均显著高于GelMA组和对照组(P<0.05)。结论浓度为600 ng/mL的TGF-β1/GelMA水凝胶支架具有促BMSCs成骨分化作用,能够显著促进颅骨缺损部位骨再生,可作为生物活性材料应用于骨组织再生。

甲基丙烯酰胺基明胶水凝胶在关节软骨损伤修复领域中的研究进展

关节软骨是一种无血管、神经和淋巴腺的组织,其含有的软骨细胞数量少且缺乏干细胞,因此关节软骨损伤后的自我修复能力有限。在接受关节镜术的患者中,60%存在软骨损伤。而软骨损伤后,大多数都会进展为骨关节炎。

甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶在创面修复领域中的应用研究进展

创面修复是临床中常见难题,严重影响患者生活质量,也给社会带来沉重负担。基于水凝胶开发的多功能敷料在治疗急性和慢性创面中显示了较强的潜力。甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)水凝胶除具备良好的组织相容性、细胞黏附性和生物可降解性等优势外,还因成本低廉、反应条件温和、理化性质可调节、临床应用广泛等而备受关注。该文介绍了GelMA水凝胶的特征及其在创面修复领域中的应用研究进展,并对用于治疗创面的多功能GelMA水凝胶敷料的未来发展进行了展望。