Geldanamycin产生菌生物合成相关基因的克隆与分析

目的 从 geldanamycin产生菌吸水链霉菌 (S.hygroscopicus)中克隆生物合成基因 ,为阐明生物合成机制及改造其结构奠定基础。方法 以链霉菌 /大肠埃希氏菌穿梭 cosmids p KC5 0 5为载体构建了插入片段为 2 0～ 30 kb的 S.hygroscopicus总 DNA文库。以利福霉素中与 3-氨基 - 5 -羟基苯甲酸 (AHBA)合成相关基因为探针 ,经菌落杂交 ,Southern杂交筛选同源基因片段。测序结果与 Genbank进行同源性比较分析 ,并以attp- 噬菌体载体 KC5 15利用基因阻断实验对克隆的基因片段进行功能鉴定。结果 构建的基因文库含重组基因比率高、基因组覆盖率高 ,稳定性好。经同源基因探针杂交 ,从文库中筛选出 9个阳性 cosmids克隆p CGB2 0、p CGB2 6、p CGB2 8、p CGB2 9、p CGB36、p CGB45、p CGB49、p CGB6 3、p CGB75。测序分析表明 ,cosmidp CGB2 0中 Bam HI- Bam HI 8kb片段两端的不完整 ORF编码蛋白与竹桃霉素 (oleandomycin) PKS Module 5、Module 6 (一致性为 79% )和红霉内酯合成酶 ORF2 (一致性为 75 % )、ORF1(一致性为 73% )、ORF3(一致性为 70 % )高度同源 ;Bam HI- Bam HI3kb片段一端与编码类结核分枝杆菌的磷酸吡哆醛依赖的氨基转移酶家族中半胱氨酸脱硫酶的 DNA有同源性 ,该家族与 AHBA合成酶关系密切。

格尔德霉素生物合成基因功能的验证

格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm)作为热休克蛋白90的特异性抑制剂,是非常有前景的抗肿瘤和抗病毒的药物,我们已从吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus17997)的基因文库中获得了Gdm大部分生物合成基因。为了研究主要基因的功能,选择了聚酮合酶基因(Polyketide synthase gene,pks)的第六模块、单加氧酶基因(Mono-oxygenase gene,gdmM)和氨甲酰基转移酶基因(Carbamoyltransferase gene,gdmN)3个基因作为靶点分别进行基因阻断,获得了基因同源双交换的阻断变株△pks、△gdmM和△gdmN。经HPLC检测证实这些基因的阻断变株均不产生Gdm,基因回复实验排除了基因阻断所可能造成的极性效应对其它基因表达的影响,说明所克隆的pks、gdmM和gdmN基因确实是Gdm生物合成所必需的基因。

格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid,AHBA)的生物合成基因簇,根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin,Gdm)起始单位的合成,而萘醌类的AHBA基因簇可能参与未知安莎化合物的生物合成。为提高吸水链霉菌17997菌种的Gdm发酵产量,并研究高产菌种在固体培养基上孢子的生长周期。采用基因阻断技术,将吸水链霉菌17997中的萘醌类AHBA生物合成基因簇(shnSOP)进行破坏,以获得ΔSOP菌株,从而减少对合成所需共同底物AHBA的争夺。HPLC分析结果表明ΔSOP菌株Gdm的发酵产量比原株提高185%。同时,通过孢子计数发现该菌株在固体培养基上的孢子生长经历2个周期,第2代孢子菌种的Gdm产量较高。

吸水链霉菌17997格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析

吸水链霉菌17997(Streptomyceshy groscopicus17997)是我所从中国云南土壤中分离到的格尔德霉素(geldanamycin,GDM)产生菌,GDM具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性,但其肝毒性和水溶性差的缺点限制了其在临床上的应用。为了实现对GDM结构的生物学改造,首先要获得GDM的生物合成基因。根据GDM后修饰基因——氨甲酰基转移酶基因(gdmN)的保守序列筛选S.hygroscopicus17997的柯斯质粒基因组文库,共获得6个阳性克隆,选择CT-4阳性柯斯质粒进行亚克隆和测序,又通过PCR延伸的方法获得了与CT4连锁的将近5kb的外源序列,共获得28.356kb的外源DNA序列,其中包含了13个可能阅读框架,通过同源比较证实该序列与S.hygroscopicusNRRL3602中的GDM生物合成基因有很高的同源性。为进一步研究GDM生物合成基因的功能,并通过组合生物学的方法改造GDM的结构奠定了基础。

格尔德霉素生物合成的调控基因

从吸水链霉菌17997中克隆了格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm)生物合成酶基因簇,通过生物信息学分析发现两个LAL(Large ATP-bindingregulators of the LuxR family)家族的调控基因gdmRI和gdmRII,基因阻断和基因回复实验证实这两个基因产物都正调控Gdm的生物合成。

环境污染物发育毒性机制研究的系统生物学方法进展

基因调控网络(gene regulatory network,GRN)是用于研究基因调控的一种新兴的系统生物学方法,尤其适合描述生物体早期发育的调控系统和机制。由于它能体现出调控过程的网络特性和动态关系,从整体的角度全面审视环境扰动所造成的真实影响,因此有望在内分泌干扰物等环境污染物的发育毒性机制研究中发挥重要作用,解决多年来一直困扰相关研究的种种难题。针对基因调控网络的结构、研究方法、应用成果和案例进行综述,并对将这一方法应用于污染物发育毒性机制研究的前景做出展望。

吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997中噬菌体基因转移系统的建立及其应用

由吸水链霉菌Streptomyceshygroscopicus 17997产生的格尔德霉素geldanamycin(GA)属安莎类抗生素 ,具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性。本文应用链霉菌温和噬菌体C3 1衍生的KC5 15载体 ,在吸水链霉菌S .hygroscopicus17997中建立并优化了S .hygroscopicus 17997的基因转染体系。利用所建立的基因转染体系 ,以基因阻断技术从S .hygroscopicus 17997基因文库含有多组PKS基因柯斯质粒中 ,鉴定了与GAPKS生物合成相关基因的柯斯质粒 。

白色链霉菌JA3453中垩唑霉素生物合成基因簇调节基因的中断研究

通过生物信息学分析,在白色链霉菌JA3453菌株的垩唑霉素生物合成基因簇中定位了2个调节基因。其中1个是属于LysR家族的调控因子编码基因ozmR,另1个为编码转录激活因子基因ozmU。为了研究这2个调节基因的功能,选用垩唑霉素的产生菌链霉菌JA3453为实验材料,采用目标PCR的方法,对调节基因ozmR和ozmU分别进行基因中断。HPLC-MS分析显示,ozmR的中断可以提高垩唑霉素的产量,ozmU的中断则没有对垩唑霉素的产量带来明显影响。这些结论为利用调节基因提高垩唑霉素的产量提供了可能。

金霉素生物合成基因簇中调控基因ctcB的功能

【目的】研究金霉素产生菌中SARP家族转录调控基因ctc B的作用。【方法】利用大肠杆菌、链霉菌的属间接合转移和同源重组双交换的方法,构建ctc B基因缺失突变株。通过c DNA在相邻同转录方向的基因间隔进行PCR验证,确定金霉素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株金霉素生物合成基因簇的转录水平检测。随后,生物信息学预测分析了金霉素生物合成基因簇内Ctc B与DNA的结合位点。【结果】获得了ctc B基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株失去产生金霉素与四环素的能力。金霉素生物合成基因簇内有6个共转录单元,其中4个共转录单元在ctc B基因缺失突变株中转录水平明显下降。软件分析预测到一致性较高的Ctc B结合重复序列。【结论】ctc B正调控金霉素生物合成结构基因ctc G-D、ctc H-K、ctc N-P、ctc W-T 4个转录单元和ctc Q,为进一步研究ctc B调控机制奠定了基础。