肝癌细胞仑伐替尼耐药的基因筛选及其通路研究

目的基于CRISPR/Cas9技术筛选肝癌仑伐替尼耐药相关基因并探究其潜在关系。方法应用CRISPR/Cas9 sgRNA全基因组文库技术结合Affymetrix表达谱芯片筛选肝癌对仑伐替尼耐药的相关基因。通过TCGA数据库分析这些基因在肝癌中的表达及预后的关系,最终确定采用THOC2为肝癌仑伐替尼耐药基因并用于后续研究。采用免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)染色、Western blotting、RT-PCR检测THOC2在肝癌细胞株(MHCC-97H、MHCC-LM3、SMMC-7721)及仑伐替尼耐药/敏感肝癌组织中的表达情况。通过慢病毒感染构建高表达THOC2的SMMC-7721-THOC2肝癌细胞,采用免疫共沉淀(Co-IP)等技术探讨THOC2介导肝癌仑伐替尼耐药的可能机制。结果发现7个与肝癌仑伐替尼抵抗密切相关的耐药基因,包括THOC2、CTNNB1(β-catenin)、MET(c-Met/HGFR)、HTATIP2、C10orf11、PRDX3、MAST4。TCGA分析提示THOC2在肝癌与癌旁中表达存在统计学差异,且与肝癌临床分期及预后密切相关。IHC染色、Western blotting、RT-PCR检测发现THOC2主要分布于胞核中,其在仑伐替尼耐药组患者中的表达水平高于药物敏感组患者;THOC2在高转移潜能的肝癌细胞株(MHCC-97H、MHCC-LM3)中的表达较在SMMC-7721中更显著;Western blotting、Co-IP进一步表明上调THOC2后Wnt/β-catenin通路下游靶点BAX、cyclinD1和c-myc蛋白水平显著增高,且THOC2与β-catenin存在相互作用关系。结论THOC2基因高表达可能通过Wnt/β-catenin通路参与调控肝癌对仑伐替尼的耐药。