马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证

马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种"大西洋"为试验材料,采用RT-PCR扩增获得马铃薯STI-LIKE基因全长片段。RT-PCR定量分析表明,该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明STI-LIKE蛋白具有3个TPR结构域,在高等植物中具有高同源性,是一个普遍存在的蛋白质。为验证STI-LIKE蛋白在拟南芥植株发育中功能,分别构建该基因强启动子表达载体(p BI121)和干扰载体(p HANNIBAL和p ART27),转化拟南芥获得了两种载体的拟南芥转基因植株,同时制备STI-LIKE蛋白抗体验证转基因植株蛋白表达。研究结果表明STI-LIKE基因可能参与拟南芥株型发育过程。

CHIP基因及其突变体的克隆及在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达

目的:热休克蛋白70羧基端作用蛋白(CHIP)是近年来新发现的同时具有辅助伴侣分子和E3泛素连接酶活性的特殊蛋白分子,但其对相应底物蛋白代谢和活性的调控机制尚不十分清楚。本研究拟构建含CHIP全长编码基因的真核表达载体,并在此基础上构建含CHIP不同功能结构域突变体和缺失体基因的表达载体,以实现这些基因在真核细胞中的高效表达,为后续探讨CHIP相关功能的实验奠定基础。方法:从高表达CHIP的人非小细胞肺癌H322细胞中提取总RNA,以此为模板,采用逆转录巢式PCR(RT-nested-PCR)获得CHIP全长编码基因,经测序确定序列正确后将CHIP基因连入带有myc标签的克隆载体pCMV-Tag1中,并以此为模板采用点突变的方法构建CHIP基因N端TPR结构域突变体K30A和C端U-box结构域的突变体H260Q以及U-box结构域缺失体U-box(-)。结果:钓取的CHIP基因经测序鉴定序列与GenBank报道完全一致,瞬时转染证实所构建的CHIP及其突变体表达载体可以在人卵巢癌SKOV3细胞中实现高效表达。结论:成功地构建并获得能够在真核细胞内高表达的CHIP及其功能域突变体的表达载体,为进一步探讨真核细胞内CHIP对相关蛋白分子的调控机制奠定了前期基础。