重组人角质细胞生长因子-2基因克隆、表达、纯化与活性分析

从人胚肺二倍体细胞KMB17中抽提总RNA ,经RT PCR扩增获得编码人角质细胞生长因子 2 (keratinocytegrowthfactor 2 ,KGF 2 )的cDNA .克隆于硫氧环蛋白表达载体pThioHisA ,序列分析表明与文献报道一致 .经IPTG诱导 ,在大肠杆菌BL2 1中实现高效表达 ,表达量可达菌体总蛋白 10 %～15 % .菌体超声破碎 ,上清经CM SepharoseFF阳离子交换 ,Heparin Sepharose亲和层析 ,Superdex 75凝胶过滤层析纯化得到重组人KGF 2 ,纯度高于 95 % .生物活性分析表明 ,它能够促进成纤维细胞NIH 3T3的增殖 ,诱导鸡胚背根神经结神经轴突的生长 ,促进鸡胚尿囊膜血管生成 .研究结果表明 ,获得了 95 %纯度的具有生物学活性的重组人KGF 2 。

IBDV南京野毒株VP2结构蛋白基因克隆与表达

用微机辅助设计合成了一对引物，用于扩增传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）中国地方株ＶＰ２基因片段。ＲＴＰＣＲ扩增出一１３２１ｂｐ的目的片段，分子杂交鉴定为ＶＰ２基因。扩增产物经双酶切后插入含噬菌体ＰＲＰＬ双强启动子的ｐＣＹＴＥＸＰ１表达质粒，构建了ＶＰ２基因克隆ｐＣＶＰ２１，经ＤｏｔＥＬＩＳＡ筛选出４个ＶＰ２表达阳性克隆。ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示有一约３２０００的目的蛋白带，且能与ＩＢＤＶ阳性血清结合。

中国人神经珠蛋白(NGB)基因克隆与序列分析

应用RT_PCR方法从中国人胎脑组织中扩增出神经珠蛋白(NGB)特异性编码基因片段,并将其克隆到pMD18_TVector中,构建了pMD18_T_hNGB克隆质粒,然后进行测序分析并与国外报道的NGB序列相比较.结果表明,本文获得的中国人NGB编码基因序列与国外序列的同源性为98%.

NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定

目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。

Galectin-1表达对LoVo细胞表型的影响

目的观察galectin-1表达对LoVo细胞表型的影响。方法构建galectin-1真核表达载体,转染LoVo细胞,细胞免疫化学检测蛋白质水平的改变,dot-blotting检测细胞培养上清分泌性galectin-1,观察LoVo细胞表型变化。结果成功构建了galectin-1真核表达载体,并建立了稳定的真核表达载体转染LoVo细胞系。galectin-1表达可降低LoVo细胞与Ⅰ型胶原的粘附,促进细胞同质粘附,且降低细胞体内成瘤(P<0.001)。结论Galectin-1表达可降低LoVo细胞恶性相关表型。

植物抗病基因研究进展

迄今为止已从植物中克隆出近30个抗病基因,基因编码产物具有富亮氨酸重复(LRR)、丝—苏氨酸蛋白激酶(STK)结构域及核苷酸结合位点(NBS)等结构特征。植物抗病基因的克隆方法主要有转座子标签技术和图位克隆技术等。

par-4 SAC基因的克隆及序列测定

目的:利用基因工程技术对par-4 SAC进行基因克隆并测定其序列,为进一步诱导肿瘤细胞靶向性凋亡的基因治疗奠定基础。方法:采用非对称互补引物/模板法,制备两端含有酶切位点的par-4 SAC的cDNA,PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体并转化感受态大肠杆菌E.coli DH5α菌株,随机挑取数个菌落,筛选鉴定并测序。结果:经酶切鉴定、测序分析,表明所插入的基因片断为par-4 SAC基因,与设计完全相同。结论:应用非对称互补引物/模板法克隆par-4SAC基因是成功及可行的。

巨噬细胞移动抑制因子基因的克隆和原核表达

目的:扩增、克隆人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组MIF蛋白。方法:根据人MIF基因序列,设计、合成PCR引物,利用RT -PCR技术从人T淋巴细胞mRNA中扩增MIF基因。将MIF定向插入原核表达载体pGEX - 4T - 1,并将构建正确的重组表达载体pGEX - 4T -MIF转化工程菌BL2 1(DE3) ,用异丙基硫代- β-D -半乳糖(IPTG)诱导表达重组MIF蛋白。用GSTrap亲合柱纯化表达产物GST-MIF ,行柱上凝血酶消化,洗脱获得MIF蛋白。用巨噬细胞移动抑制试验(MMI)鉴定MIF蛋白的生物活性。结果:限制性内切酶分析和DNA测序结果表明,成功构建了重组质粒pGEX - 4T -MIF ,人MIFcDNA长348bp ,编码115个氨基酸。经IPTG诱导,高效表达出可溶的GST -MIF蛋白。SDS -PAGE和Westernblotting分析显示,GST -MIF经凝血酶消化,获得13kU的MIF蛋白。MIF蛋白对巨噬细胞移动的抑制率达30 % ,具有生物活性。结论:克隆、测定了人MIF基因,在大肠杆菌表达出具有生物活性的MIF蛋白。

藏酋猴类似人clock基因片段的克隆

目的:在藏酋猴中,寻找和克隆与人clock基因类似的基因。方法:提取藏酋猴外周血白细胞RNA,逆转录为全基因组cDNA,利用人clock基因保守序列设计相关引物,克隆,测序,进行生物信息学分析。结果:扩增得到1994bp的核酸序列。该序列与人,苏门答腊猩猩,绵羊,小鼠,褐家鼠,原鸡和蟾蜍clock基因核酸序列同源性分别为99%,98%,94%,90%,90%,82%和75%。结论:藏酋猴基因组中存在与人clock基因相似的基因,该基因可能为藏酋猴clock基因。

凤丹牡丹PoFAD7基因的克隆及表达分析

3脂肪酸脱氢酶能将亚油酸催化合成ɑ-亚麻酸,是植物脂肪酸生物合成的关键酶。以凤丹牡丹(Paeonia ostii)种子为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法克隆获得凤丹牡丹脂肪酸脱氢酶7基因cDNA片段,命名为PoFAD7(GenBank登录号:MK205360);生物信息学分析表明其包含完整的开放阅读框,推测编码的蛋白质含有450个氨基酸,具有2个跨膜结构域。蛋白质氨基酸序列比对分析表明,PoFAD7含有3个保守的组氨酸基序,而系统进化树分析结果显示凤丹牡丹与同属芍药属的芍药亲缘关系较近。对不同发育时期种子中PoFAD7基因的表达分析结果表明,该基因在凤丹牡丹授粉100 d的种子中相对表达量最高,结合凤丹牡丹种子中亚油酸和α-亚麻酸的累积规律,推测PoFAD7在催化亚油酸合成α-亚麻酸的反应中发挥一定的功能,但可能并不是α-亚麻酸合成的主效基因。